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胰蛋白酶突变体文献资料
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重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析
胰蛋白酶是肽链内切酶,专一性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键.胰蛋白酶切割胰岛素原生成胰岛素,在胰岛素的生产中发挥着重要作用,但由于胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸的切割选择性差别不大,会在切割反应中产生副产物.所以研究开发对底物切割选择性增强的胰蛋白酶,减少胰岛素生产过程中副产物的产生具有较高的应用价值.以猪源胰蛋白酶原基因为模板,通过重叠延伸产生特异位点突变的方法扩增突变胰蛋白酶原(TgM)基因,该基因编码猪胰蛋白酶的Ser172Ala突变体.将TgM基因插入到表达载体pET28a中,转化E.coli DH5α,利用卡那霉素抗性筛选出构建成功的重组质粒pET28a-TgM并将其转化E.coli BL21(DE3),构建含TgM基因的工程菌株并诱导表达.14％ SDS-PAGE显示,重组菌经乳糖诱导后表达了目的蛋白,并以包涵体形式存在.包涵体经尿素裂解液变性后,通过稀释法复性,复性液超滤处理并用胰蛋白酶切割,经DEAE-FF离子交换层析分离纯化.纯化蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明与胰蛋白酶条带位置相同;用紫外分光光度法检测酶活力,测得突变胰蛋白酶的酶活力为1 300 U/mL,比活力为1 566.27 U/mg.将终纯化获得的突变胰蛋白酶用于胰岛素原的切割,HPLC检测分析结果表明,突变胰蛋白酶对底物中Arg的切割选择性大于Lys,因此在对胰岛素原的切割反应中,副产物的量明显减少.
