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核糖体展示技术的原理与应用
通过构建分子文库(cDNA文库、随机肽库、抗体库及其它蛋白文库),采用合适的筛选技术可以非常方便、有效、快速地筛选生物活性物质.目前分子文库技术已经广泛应用于抗原表位分析、功能小肽分子(如肽类拮抗剂和激动剂)或功能蛋白分子(如抗体)的筛选和改造等领域.筛选技术主要有两类:1. 体内筛选技术,如噬菌体展示技术[1]、选择性感染噬菌体技术[2]等.
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大肠杆菌表面CS3菌毛展示随机肽库的构建
目的:在肠毒素性大肠杆菌CS3菌毛表面构建10肽随机肽库.方法:首先将原有的单酶切CS3菌毛呈现载体改造为双酶切载体,并证实改造后的载体能正确形成CS3菌毛.同时设计合成2条寡核苷酸序列,链1含有1个10肽随机编码序列(NNS)10,链2可与链1的3'端互补.两条链经过退火、延伸、酶切和回收与经过同样酶切的呈现载体连接,连接产物纯化后分多次电击转化,获得随机肽库.随机挑选10个克隆进行测序并对测序结果进行分析.结果:获得1个库容量为1.8×106大小的随机肽库.测序结果显示,所构建肽库的基本框架与预期设计相符,4个寡核苷酸出现的频率也与理论值相接近.结论:在肠毒素性大肠杆菌CS3菌毛表面成功构建库容量为1.8×106大小的10肽随机肽库.为下一步利用肽库进行筛选奠定了基础.
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噬菌体展示技术的原理及应用
0引言1985年Smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造,将EcoR Ⅰ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,表达产物能被抗EcoR Ⅰ内切酶抗体所识别.1988年Parmley et al[2]将已知抗原决定族与pⅢ的N端融合呈现在表面,可特异性地被抗体选择出来,并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.1990年McCafferty et al[3]也报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法,从而开始了这项技术的广泛应用的新时代.
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不同靶标的噬菌体展示肽库筛选的研究新进展
噬菌体展示技术自建立以来,经过十几年的发展,逐渐成为一个强有力的筛选工具.用于筛选的靶标也越来越具有多样性,不仅是分子,新鲜分离或培养的细胞,甚至活体器官都可作为筛选的对象,使这一技术有了更广泛的应用前景.
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从随机肽库中筛选与β1肾上腺素能受体有结合活性的小肽
目的用噬菌体肽库技术筛选与β1肾上腺素能(β1-AR)受体有结合活性的小肽,为初步建立一种检测受体数目的方法和研究模拟小肽的生物学活性打下基础.方法以合成β1-AR细胞膜外第2环多肽序列为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,并用酶联免疫吸附分析法(ELISA)和竞争抑制实验鉴定阳性克隆的结合性和特异性.结果经3轮筛选,阳性克隆得到富集,在30个阳性克隆中,有2个阳性克隆可与靶分子有较强结合活性,其中1个能特异性阻断抗β1-AR兔血清多抗与靶分子结合.结论该小肽与靶分子有特异性结合.
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利用细菌鞭毛展示的随机肽库筛选HBV-PreS2蛋白表位
目的建立、改进并完善从细菌表面展示随机肽库中进行抗原表位筛选及鉴定的方法.方法以1株抗HBV-PreS2的单克隆抗体3B9为靶标,对FliTrxTM随机肽库进行筛选;监测每轮与抗体特异性结合的细菌克隆富集情况;通过逐轮增加洗涤强度筛选高亲和力克隆;对筛选出的克隆进行序列测定和Western blot鉴定.结果筛选过程中与抗体特异性结合的细菌克隆逐轮得到富集,对16个克隆进行序列测定,共获得10种序列,其中7个序列含典型的RXR(K)GXY保守序列,与病毒PreS蛋白135～140位氨基酸高度同源,Western b1ot反应为阳性;另外3个序列均不含典型的RXR(K)GXY结构,Westem blot反应结果不一.结论细菌表面展示的随机肽库是一种简捷、快速的抗原表位筛选方法.
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从噬菌体随机肽库中筛选IL-6抗体的识别表位
目的:从噬菌体随机6肽文库中筛选IL-6抗体的识别表位.方法:利用具有IL-6中和活性的单抗C220筛选呈现于丝状噬菌体表面P3蛋白的随机6肽文库.结果:从噬菌体随机6肽文库中筛选出36株可与单抗特异结合的噬菌体克隆, 其中多数克隆呈现核心序列 SWLR,该序列与 IL-6 的序列具有一定同源性.竞争结合实验和Western印迹分析,带有 SWFNLR 和 HSWLRY小肽的2株噬菌体克隆可与IL-6竞争结合单抗C220.结论:SWFNLR 和 HSWLRY 是IL-6单抗C220特异识别的表位.
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结核分枝杆菌抗原模拟表位肽的筛选及免疫活性鉴定
目的:从噬菌体随机12肽库中筛选结核分枝杆菌模拟抗原表位,并初步研究其免疫活性.方法:以鹿结核阳性血清纯化多克隆抗体IgG作为固相配基筛选噬菌体随机12肽库,按吸附-洗脱-扩增过程进行3轮筛选,随机挑取20个单克隆进行特异性鉴定,将筛选后得到的阳性克隆扩增后免疫BALB/c小鼠作为实验组;以TBS为阴性对照组,BCG为阳性对照组,采用间接ELISA方法检测抗体效价,MTT法检测淋巴细胞增殖能力.每组小鼠免疫3周后再鼻腔接种BCG,3周后无菌取左全肺研磨计算肺脏荷菌量,取右全肺制备病理切片观察肺脏病理变化.结果:经三轮筛选后阳性克隆得到富集,ELISA鉴定20个单克隆中有15个阳性克隆,阳性率为75%.免疫后实验组小鼠抗体水平高于BCG组(P<0.01).小鼠脾淋巴细胞增殖实验,经ConA、LPS、PPD刺激后实验组SI值均高于BCG组,但差异无显著性(P>0.05),与TBS组比较差异有显著性(P<0.01).实验组、BCG组均观察到少量的淋巴细胞浸润,而TBS组肺泡结构消失,组织发生实变.肺脏荷菌量实验显示实验组肺脏荷菌量[(4.080±0.035)log CFU·mg-1)]低于TBS组[(4.360±0.110)log CFU·mg-1](P<0.01),但高于BCG组荷菌量[(3.980±0.023)log CFU·mg-1](P>0.05).结论:成功筛选得到含有结核分枝杆菌抗原模拟表位的阳性克隆,这些阳性克隆能有效诱导小鼠产生比BCG更高的抗体效价和保护效应,对其进行进一步序列测定和功能分析将有助于结核病疫苗的开发.
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噬菌体表达短肽模拟乙脑病毒糖蛋白的研究
为研究日本脑炎病毒(JEV)E蛋白模拟肽,将抗JEV E蛋白的mAb 2H4淘筛噬菌体15肽库.经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后,随机挑取10个阳性克隆,测序并与JEV E蛋白同源比较.将阳性噬菌体免疫小鼠,检测血清中特异性抗体.ELISA结果显示筛选到的噬菌体能特异地与mAb 2H4结合,并且这种结合可被JEV天然抗原所竞争抑制.10个阳性克隆的氨基酸序列相同:-RQDPQWPYANSTIAR-,同源分析得到的序列STXAR可能为mAb 2H4识别的模拟表位.阳性噬菌体表达的15肽能够刺激小鼠产生特异性抗体.该噬菌体表达短肽模拟JEV E蛋白的部分抗原性.
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噬菌体随机肽库的应用现状
简要介绍了噬菌体肽库的构建原理及筛选方法,并分析了噬菌体肽库在寻找未知的抗原表位、疾病检测、疫苗研究、多肽药物筛选等领域的应用.
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应用噬菌体展示随机肽库淘筛mAb5H5识别的抗原表位
本文利用噬菌体随机9肽库探索汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)B细胞抗原表位.以抗HTNV NP单克隆抗体(mAb)5H5作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈的随机9肽库.阳性克隆经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后,随机挑取10个克隆,DNA测序,与HTNV 76～118株S基因进行同源性分析.结果显示筛选到的噬菌体能特异地与5H5结合,这种结合可被天然抗原所抑制.10个克隆的氨基酸序列相同,均为VRDAEEQYE,与76～118株NP氨基端的aa25～33一致.证实了该线性表位是mAb 5H5识别的表位,噬菌体肽库有助于病毒抗原表位的确定.
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噬菌体肽库筛选血小板衍生生长因子受体β链(PDGFRβ)亲和短肽及其抗肝纤维化实验研究
目的:从噬菌体随机肽库中筛选血小板衍生生长因子受体β链(PDGF-Rβ)的亲和短肽并探讨其对CC14诱导的肝纤维化模型中的抗肝纤维化作用.方法:以重组可溶性人PDGF-Rβ作为靶标,应用噬菌体随机十二肽库进行筛选,经过3轮淘选,提取阳性噬菌体克隆ssDNA,测序并进行序列分析,选择其中出现频率高的展示肽,并根据其氨基酸序列人工合成亲和短肽,应用亲和短肽实施抗肝纤维化试验,设亲和短肽C1组亲和短肽C2组,秋水仙碱组,模型组,空白组,造模五周后处死采血,通过分析肝脏中的HPY水平并对肝脏进行病理组织学检查,检测其抗肝纤维化的作用.结果:人工合成的亲和肽PDGF-RβC1用于抗肝纤维化治疗能减轻炎症,减少胶原纤维形成,ALT羟脯氨酸与肝纤维化小鼠模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:通过噬菌体肽库技术能筛选出与PDCF-Rβ结合的噬菌体展示肽可以改善实验性肝纤维化小鼠的肝脏组织结构和肝功能.
关键词： 随机肽库 血小板衍生生长因子受体β链 肝纤维化 亲和肽 Masson染色 -
巨噬细胞移动抑制因子活性抑制肽的筛选和鉴定
目的:巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitoryfactor,MIF)参与了多种病理生理过程,如多种类型的感染以及关节炎、肾小球肾炎等自身免疫疾病以及动脉粥样硬化的发生、形成过程.本文将利用酵母双杂交技术从预制随机肽库中筛选能有效抑制MIF活性的多肽,为研制MIF活性抑制剂提供候选分子.
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丝状噬菌体随机呈现肽库的构建与鉴定
目的:构建一个随机20个氨基酸的丝状噬菌体肽库.方法:扩增随机合成DNA模板,经限制性内切酶XhoⅠ+SpeⅠ酶切后克隆进噬菌粒pTMB2,构建随机丝状噬菌体肽库并检验其库容及随机性.结果:完成丝状噬菌体随机肽库的构建,其库容为2.1×108,其氨基酸分布于理论频数无显著差异.结论:丝状噬菌体随机肽库被成功构建.
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酵母双杂交随机肽库的设计及构建
目的构建一个含16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库.方法设计合成编码16肽的随机DNA片段,PCR扩增随机DNA片段,经限制性内切酶BamH I和EcoR I酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7 GH,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH-RP并检验其库容.结果扩增获得编码16肽的随机DNA片段,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,与GAL4AD形成融合蛋白,其库容为1.28 × 107.结论成功地构建了酵母双杂交随机肽库.
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单纯疱疹病毒糖蛋白模拟位的研究
目的为了充分认识单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白的抗原表位,寻找HSV多组分疫苗和新型基因工程疫苗更有效的小片段短肽作为该病毒疫苗的备选免疫原.方法利用有动物保护活性的抗HSV糖蛋白C(gC)单克隆抗体(McAb)1A12淘筛噬菌体随机12肽库,经4轮筛选后进行ELISA检测,随机挑取14个阳性克隆进行序列测定,序列比较后得到保守序列,做ELISA阻断实验进一步鉴定筛选结果并与相关天然蛋白HSV gC进行序列比较.结果获得保守序列-SG(L)RHII-和其侧翼辅助序列-AK-、-VW-,其与天然相关蛋白HSV gC 114～116位氨基酸十分相似.携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合,并可部分阻断抗体与HSV囊膜抗原的反应.结论所筛选到的保守序列可模拟McAb针对的抗原表位,可能是HSV的替代抗原.这一研究方法有望使短肽替代庞大的糖蛋白全长氨基酸序列,为研制更有效及更广谱的基因工程疫苗提供依据,也使研制基于抗原表位水平的特异诊断试剂成为可能.
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HCV包膜蛋白E2的B细胞抗原模拟表位的筛选、重组表达与抗原性鉴定
目的采用蛋白质/多肽递呈技术对HCV包膜蛋白E2进行模拟表位研究.方法通过使用E2蛋白结合血清中的抗-E2,筛选M13噬菌体构建的随机肽库,寻找E2区蛋白的模拟表位;用大肠杆菌硫氧还蛋白作为骨架,在其活性部位以"内融合"形式重组表达该模拟表位,用HCV感染者血清验证重组蛋白的抗原性.结果寻找到一个E2区蛋白的模拟表位,可能为E2蛋白的构象性表位.结论本实验为研究HCV外膜蛋白E2抗原表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据.
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NF-κB p50亚基同源结构域相互作用多肽的筛选
目的:应用酵母双杂交技术筛选获得与核因子κB(NF-κB)p50亚基同源结构域(RHD)相互作用的多肽.方法:应用酵母双杂交技术,以NF-κB p50 RHD为诱饵,筛选16肽cDNA文库,寻找与其相互作用的多肽,应用β-gal试验、酵母交配试验及一对一酵母回复性杂交等方法筛除假阳性克隆,确定阳性克隆.结果:经酵母双杂交及反复的排查,共获得8个阳性克隆.通过GenBank进行检索,未发现与之相匹配的蛋白序列.结论:获得8个与NF-κB p50 RHD相互作用的新型多肽,多肽的功能需进一步验证.
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从 HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库中筛选抗原表位
目的探讨病毒抗原序列研究的新方法。方法应用噬菌体展示技术，筛选 HCV核心蛋白的抗原序列。用抗 -HCV核心抗体单独阳性的血清，对已构建的 HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库进行 4轮筛选，检测筛选阳性的克隆数、插入阳性率和杂交阳性率来评价筛选的效果。测定和分析 7个杂交阳性克隆的 DNA序列。结果所测定的 7个序列中， 6个为 HCV核心蛋白序列，其中 5个被正确地展示于噬菌体表面， 1个可能被正确展示，这些序列均含有重要的 HCV核心抗原表位。另 1个为大肠杆菌 nrfa基因。结论噬菌体展示技术完全可应用于病毒蛋白抗原序列的筛选，并具有简便、快速、准确的优点。
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抗单纯疱疹病毒单克隆抗体CHA9靶基因的定位
目的: 获得单纯疱疹病毒(HSV)新糖蛋白g30K的部分特征氨基酸信息, 以期对该蛋白基因的准确定位有所帮助.方法:将针对HSV新糖蛋白g30K的单克隆抗体(mAb) CHA9生物素化后, 淘筛噬菌体随机12肽库, 经3轮筛选后进行ELISA检测.随机挑取10个阳性克隆进行DNA测序, 并进行序列比较以得到保守序列, 然后对其疏水性进行预测. 结果: 得到的保守氨基酸序列(motif)为-PH/KHXHXGS-.携有此短肽的噬菌体可与CHA9特异结合而不与其它IgG出现交叉反应.疏水性分析证明其可能构成一个表位.结论: 筛选到一段具有含mAb CHA9 靶抗原-HSV新糖蛋白g30K部分氨基酸特征的短肽, 为新基因的预测提供了参考依据, 对进一步分析这一新糖蛋白的生物学功能也具有重要意义.
