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中医方药作用特点及现代药效评价标准的缺陷
目前国际生物医学界对中医药提出频繁的要求是:证据(Evidence)[1～5].寻找证据面临两大主要问题:一是中药作用的物质基础;二是疗效的标准及判定.目前普遍关心和重视的是前者,姑且不论能否搞清中药药效物质,然而是否搞清了物质基础就等于阐明了中药复方,事实上问题远非如此简单.无论是中药复方、单味药或活性组分和单体,在鉴定其有无药理活性时其活性如何定位?新药研究药效学的国家标准基本模拟相应西药药理学;国际或国内分离提纯植物药单味药或复方的成分后,对其活性鉴定时也大多以此为标准或想当然将中药功效与现代药理划等号.
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VEGFR-32-Ig反义多肽的原核表达及生物活性鉴定
目的将VEGFR-3 2-Ig的反义基因在体外进行原核表达,并将产物进行生物活性鉴定.方法构建VEGFR-3 2-Ig反义基因的原核表达载体,经过原核表达、亲和层析及蛋白酶切后获得将VEGFR-3 2-Ig的反义多肽,用MTT 法进行活性鉴定.结果获得VEGFR-3 2-Ig的反义多肽,MTT 法证明VEGFR-3 2-Ig的反义多肽具有较强生物学活性.结论成功获得VEGFR-3 2-Ig的反义多肽,为研究和利用反义多肽提供了实验理论依据.
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重叠延伸PCR法克隆重组复合干扰素
目的:用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人工优化的干扰素.重组复合干扰素(consensus interferon,clFN)基因,用原核表达系统对其进行表达,鉴定表达的clFN活性.方法:根据大肠杆茵的偏爱密码子,人工设计cIFN的高表达基因,用overlap PCR法合成cIFN全基因.用基因重组技术构建其原核表达载体pRA-cIFN,在大肠杆茵BL21中进行高效表达,用SDS-PAGE和Western blotting鉴定cIFN表达,用GuHC1阶段透析法进行蛋白变性、复性,用TALON(His)6亲和层析柱进行纯化.用EUSA、MTS比色定量法及血凝抑制试验检测cIFN的免疫活性和生物活性.结果:成功合成了cIFN全基因,其DNA长度与理论长度534 bp相符;用基因重组技术成功构建了cIFN原核表达栽体pRA.cIFN,并用大肠杆茵BL21进行了高效表达,SDS.PAGE和western blotting鉴定结果显示,表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量符合理论值23.3 kDa:用GuHCl阶段透析法成功进行包涵体蛋白的复性.亲和层析法纯化后cIFN的ELISA、MTS比色定量法及血凝抑制试验结果显示,表达蛋白具有明显的cIFN免疫学活性、剂量依赖性PLC/PRF/5细胞增殖抑制作用和HBsAg分泌抑制作用.结论:重叠延伸PCR法是获得重组复合基因的有效简便的方法,我们通过重叠延伸PCR法获得并表达的cIFN具有明显的抗病毒、抗细胞增殖活性.
关键词： 重组复合干扰素 重叠延伸PCR.原核表达 活性鉴定 -
抗肝癌人源化单链抗体hscFv25的体外亲和力成熟
目的:提高人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的亲和力.方法:设计并合成人源化抗肝癌单链抗体hscFv25重链及轻链CDR3的半随机突变引物,构建突变体抗体库,竞争筛选亲和力更高的突变体抗体,对所得到的高亲和力的候选抗体,在大肠杆菌中进行可溶性表达,并采用细胞ELISA、细胞涂片免疫组织化学染色的方法,对该抗体进行初步的活性鉴定.结果:得到了3株候选高亲和力突变体抗体,其中的一株在大肠杆菌中获得了可溶性表达后,进一步的活性检测结果表明,该抗体的相对亲和力比亲本单链抗体提高了60倍左右,同时该抗体对肝癌细胞(SMMC-7721)的免疫组织化学染色呈强阳性,着色情况与亲本抗体相一致,而对正常肝细胞(HL-02)染色呈阴性.结论:成功地构建了人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的突变体抗体库,并筛选到了一株亲和力更高的突变体抗体.
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大肠杆菌错配识别蛋白MutS的表达与活性鉴定
目的 构建表达错配识别蛋白MutS,并进行错配识别活性鉴定.方法 在大肠杆菌中表达MutS蛋白,并纯化获得目的 蛋白;利用凝胶滞缓实验对错配识别活性进行验证,并计算MutS蛋白降低的错配率.结果 纯化的MutS蛋白具有错配识别活性,并能降低DNA双链的错配率.结论 表达纯化的MutS蛋白在体外具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性,从而有助于合成生物学的发展.
关键词： 错配识别蛋白MutS 表达 纯化 活性鉴定 -
MDR1 基因单靶点双荧光素酶报告基因系统的建立
目的 通过构建以MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并进行活性分析,为MDR1基因表达的单靶点调控研究和逆转剂的筛选提供一种有效的方法.方法 从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子中Y-box序列.将该序列重组到萤光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1.将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中.通过调节不同载体的比例来优化转染效率.利用MDR1基因激活剂(热诱导)和抑制剂(EGCG)等处理来分析其启动转录活性受外界因素的影响.结果 通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子Y-box序列且没有出现碱基突变.在pGL-MDR1和pRL-TK的转染比例为5:5时,转染效率高并具有高的萤光素酶活性.通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反.结论 MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统建立成功.该系统不但可以用于研究活体生物发光成像和MDR1基因表达的机理,而且可用于单靶点的多药耐药抑制剂的筛选.
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MDR1启动子的活性研究
目的:克隆编码多药耐药基因-1(MDR1)中不同长度的启动子片段并探讨和比较其在乳腺癌细胞中的转录活性.方法:利用PCR扩增技术以MCF-7/ADR细胞基因组为模板克隆3种不同长度的启动子片段.pGL3-basic的启动区域中,构建一系列报告基因载体pGL3-MDR1Pn.以pGL3-control为阳性对照,分别将含不同长度的MDR1启动子的报告基因载体pGL3-MDR1Pn与pRL-TK以一定比例共转染到敏感的MCF-7细胞和耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞,通过分析表达的荧光素酶的活性比较不同长度的启动子片段在这两种细胞中的转录活性.结果:酶切鉴定和测序验证了已将不同长度的MDR1启动子片段成功插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,且克隆的片段中没有出现碱基突变.将表达载体转染细胞后活性检测结果显示,pGL3-MDR1P1、pGL3-MDR1P2和pGL3-MDR1 P3在MCF-7中活性分别为阳性对照的(13.03±2.35)％、(14.60±3.57)％和(10.27±1.89)％;而在MCF-7/ADR中活性分别为阳性对照的(105.26±6.84)％、(59.08±4.95)％和(62.39±5.76)％.结论:成功克隆了MDR1启动子片段,并成功构建了荧光素酶报告基因载体pGL3-MDR1P.启动子的活性分析结果初步表明长度约为2 000 bp的MDR1P1在MCF-7/ADR中具有相对较高的特异性.
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以LasR蛋白为靶标的群体感应活性物质虚拟筛选及鉴定
① 目的 通过计算机虚拟筛选得到新型群体感应活性物质,并对其进行活性评价.② 方法 以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)群体感应系统受体蛋白LasR为研究对象,从Zinc化合物库中筛选出34个与LasR蛋白结合较好的化合物,并对其中2个化合物(A{ZINC02316089(STL038792)}、C{ZINC01130988(STK135354)})在不影响PA生长的浓度范围内,利用RT-PCR检测与QS调控相关基因的表达影响,及对PA质控菌株和临床分离株弹性蛋白酶 、生物膜形成的作用.③ 结果 虚拟筛选所得的得分较高化合物在不影响PA生长的浓度范围内,能够降低多种QS调控相关基因的表达,并能对PA弹性蛋白酶 、生物膜形成和动力作用产生影响.④ 结论 从ZINC数据库中发现了两种具有群体感应抑制活性的化合物,为进一步探索研发新型抗菌药物奠定基础.
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HIV多抗原位点串联基因的表达及活性鉴定
目的在原核表达载体系统中对HIV-1/2型外壳蛋白多个抗原位点串联基因进行表达、纯化并鉴定其活性.方法人工合成含HIVgp41的2个抗原位点、gp 120的3个群的各3个抗原位点及gp 36的2个抗原位点的串联基因,克隆到原核表达载体pRSETB中,构建重组表达质粒pRSETB-env,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其在大肠埃希菌BL21(DE 3)中高效表达,利用固化金属离子配体亲和层析技术纯化表达蛋白,利用逐渐降低尿素浓度透析法使目的蛋白复性.用免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定.结果目的基因在BL 21中有较高表达率,纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见一条约32 KD的蛋白带,与设计分子量相符.免疫印迹、ELISA试验显示该表达蛋白可与HIV患者血清较好结合,而与其它患者血清无交叉反应.结论成功构建了由HIV外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env,并在原核细胞中高效表达,表达蛋白经一步纯化后纯度较高,并具有良好特异性和活性.
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小鼠HMGB1 B box基因的原核表达及其活性鉴定
目的:克隆小鼠HMGB1 B box基因,表达具有明显致炎活性的鼠HMGB1 B box蛋白,为深入研究其生物学功能以及新型抗炎制剂的研发奠定基础,也为进一步探讨其与H5N1禽流感病毒性肺炎的相关性奠定了基础.方法:从小鼠的肺脏组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增小鼠HMGB1中的B box的cDNA,构建于载体pMD-18T并进行序列测定,随后构建于原核表达载体pET-28a(+)中.IPTG诱导4小时后可见Mr约13 000的蛋白.经Ni2+ 亲和层析柱纯化获得高纯度的HMGB1 B box 蛋白,然后用此蛋白刺激小鼠外周血单核细胞(PBMCs),作用6小时后用ELISA检测PBMCs释放TNF-α、IL-6的含量.结果:经RT-PCR扩增得到了240 bp的DNA片段,经序列分析与Genebank 中报道的已知序列完全一致;成功构建了含有HMGB1 B box编码序列的原核表达载体;纯化表达的HMGB1 B box蛋白能显著地刺激小鼠PBMCs释放致炎因子TNF-α、IL- 6,具有较好的生物活性.结论:原核表达的小鼠HMGB1 B box蛋白具有较好的生物活性,为进一步研究HMGB1 B box的作用机制以及新型抗炎制剂的研究奠定了基础.
关键词： 高迁移率族蛋白B1 B box 原核表达 活性鉴定 -
抗H5N1禽流感病毒羊驼重链单域抗体的制备和功能鉴定
目的:获得具有中和活性、高特异性和稳定性的抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的羊驼重链单域(VHH)抗体.方法:利用pET-22b表达载体诱导表达抗H5N1禽流感病毒HA VHH抗体蛋白,以包涵体形式表达的VHH抗体蛋白采用优复性方法进行复性后,获得高纯度的VHH抗体,分别采用ELISA法鉴定VHH抗体的亲和力和热稳定性,采用血凝抑制实验鉴定抗体的特异性和体外中和活性.结果:经复性的抗H5N1禽流感HA VHH抗体对H5N1禽流感病毒HA具有良好的特异性.通过对三种不同复性方法比较,利用柱上复性的VHH23抗体具有较好的热稳定性,亲和力为9.1×10-7 mol/L,同时对H5N1禽流感病毒HA具有良好的体外中和活性.结论:实验结果表明通过原核表达获得具有较好中和活性、特异性及稳定性的抗H5N1禽流感病毒VHH抗体,为进一步开展抗体的体内病毒中和试验奠定良好基础.
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重组钩端螺旋体多抗原位点同源合成基因的表达及其抗原性鉴定
目的:构建重组钩端螺旋体(钩体)优势抗原表位原核表达系统,以期获得高纯度的钩体优势抗原表位重组融合蛋白,为进一步研究钩体快速检测方法奠定基础.方法:利用基因重组的方法构建表达质粒pET-rLP.经IPTG诱导后,获得高效表达带组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白,包涵体蛋白经尿素变性溶解,采用镍离子亲和纯化,利用SDS-PAGE、Western blotting和间接ELISA法鉴定.结果:在相对分子质量为20000处有1条特异性蛋白条带,为重组钩体优势抗原表位融合蛋白;ELISA结果显示其可与钩体阳性血清特异性结合,而与其他血清无交叉反应.结论:成功构建重组钩体优势抗原表位原核表达系统,并获得高纯度的重组钩体优势抗原表位融合蛋白.
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HIV多抗原位点同源序列合成基因的表达及活性鉴定
目的:在原核表达载体系统中对HIV-1gp41/gp120和HIV-2gp125/gp36外膜蛋白多个抗原位点同源序列合成基因进行表达、纯化并鉴定其活性.方法:人工合成含HIV-1gp41的3个抗原位点、HIV-1gp120的2个抗原位点、HIV-2gp125的3个抗原位点和HIV-2gp36的1个抗原位点的串联基因,克隆到原核表达载体pRSETB中,构建重组表达质粒pRSETB-env,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,采用金属离子亲和层析技术纯化表达蛋白,逐渐降低尿素浓度使目的蛋白复性,免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定.结果:目的基因在BL21中有较高表达率,纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见相对分子质量约44 000的蛋白带,与设计相对分子质量相符.免疫印迹、ELISA试验显示pRSETB-env质粒的HIV-1/2表达蛋白与HIV-1及HIV-2患者血清都能较好地结合,与其他患者血清无交叉反应.结论:成功构建了由HIV-1/2外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env,并在原核细胞中高效表达,表达蛋白经纯化后纯度较高,并具有良好特异性和活性.
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肠出血性大肠杆菌转移紧密黏附素受体的表达及其活性鉴定
目的:在原核表达基因工程茵中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转移紧密黏附素受体(Translocated Intimin Receptor,Tit)蛋白的高效表达,并对其活性进行初步鉴定.方法:采用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中调取tir基因,插入pEASY-T1 克隆栽体.克隆质粒测序鉴定后,采用Nde Ⅰ、Xho Ⅰ限制性核酸内切酶双酶切pEASY-Tl-tit质粒获得tir基因,连接同样经过双酶切的pET-22b(+).表达质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测相对分子质量,Western blotting验证抗原活性.荧光显微镜观察蛋白是否具有嵌入细胞膜的活性.结果:PCR扩增得到1686bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b(+)-tir经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以裂解上清形式表达,表达量约3mg/ml.经镍柱纯化后纯度达90%以上.重组表达的Tir具有嵌入细胞膜的生物学功能.结论:成功表达了具有生物活性的重组Tir蛋白,为Tir的功能研究奠定基础.
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重组可溶性人IL-6的原核表达纯化和活性鉴定
使用大肠杆菌BL21(DE3)重组表达可溶性人IL-6并对其进行纯化和活性鉴定.以入激活T细胞总RNA为模板,逆转录PCR扩增人IL-6的基因片段并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件获得可溶性表达目的蛋白.细菌裂解上清经镍金属螯和层析纯化,SDS-PAGE鉴定其分子量大小,western blot鉴定其免疫原性,并通过IL6依赖的细胞株T1165分析重组蛋白的活性.成功构建了pET32a(+)/IL-6表达载体,并获得了可溶性表达的重组人IL-6蛋白.SDS-PAGE显示,其分子量约为21kD,可被抗IL-6抗体特异性识别,并且该重组蛋白可刺激IL-6依赖的细胞株T1165增殖,比活性与标准品一致,约为1×106 U/mg.本实验获得了可溶性高表达的重组人IL-6蛋白,为进一步研究人IL-6奠定了基础.
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羊驼抗H5N1血凝素重链可变区-人IgGFc段嵌合抗体的制备和鉴定
本研究旨在制备羊驼抗H5N1禽流感病毒的重链抗体可变区-人Fc段嵌合体抗体制备,对所得嵌合抗体进行制备和功能鉴定,为临床应用奠定基础.用pET-22b表达载体构建抗H5N1禽流感病毒羊驼重链可变区(VHH)-人IgG1Fc嵌合基因,以包涵体形式表达VHH23-hFc嵌合抗体蛋白,采用优化的方法复性后,获得高纯度VHH23-hFc嵌合抗体,用ELISA法鉴定嵌合抗体亲和力、热稳定性和小鼠体内的半衰期.结果显示,透析复性后原核表达的抗H5N1禽流感病毒VHH23-hFc嵌合抗体亲和力为2.24×106 mol/L,具有较好免疫学活性,热稳定性也较好,小鼠体内半衰期达到35 h,为下一步开展该抗体的体内外病毒中和试验奠定良好基础.
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重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定
目的:克隆并表达canstatin基因,初步检测其抑制血管生成的活性.方法:采用RT-PCR方法从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA,克隆人pMD18-T载体中,并测序鉴定.在QIA表达系统中表达,Ni柱亲和层析纯化.进行生物学活性鉴定.结果:经序列分析所获684 bp人canstatin基因与报道一致,重组进pQE30表达载体,IPTG诱导表达并纯化成功,表达产物能明显抑制血管生成.结论:成功构建人canstatin cDNA克隆和表达载体并在大肠杆菌M15中高效表达.纯化回收产物在鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)实验中具有明显抑制血管生成活性.
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何首乌二苯乙烯合成酶基因FmSTS2的克隆,鉴定和与二苯乙烯苷表达关系分析
克隆并鉴定何首乌中二苯乙烯合成酶基因FmSTS2,并研究其在何首乌各组织的表达与二苯乙烯苷表达的关系,为研究二苯乙烯合成酶基因在二苯乙烯苷合成及其调控中的功能奠定基础.采用互补cDNA末端快速扩增技术克隆目的片段,得到一种二苯乙烯合成酶基因FmSTS2(GeneBank登录号:JX914503),其互补cDNA全长1 644bp.将FmSTS2连接pET-28a原核表达载体并转化BL21大肠杆菌构建原核表达系统,Ni-NTA亲和树脂纯化可溶性蛋白后以丙二酰-COA和香豆酰-COA为底物进行催化反应,HPLC鉴定反应产物为含有二苯乙烯母核的白藜芦醇,证明FmSTS2是一种二苯乙烯合成酶基因.HPLC测定何首乌各组织二苯乙烯苷含量；RT-PCR检测何首乌的块根,老藤,茎,叶中表达FmSTS2的程度依次降低,与二苯乙烯苷在各个组织的含量高低一致.
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灵芝蛋白质的分离及其免疫活性研究
利用凝胶层析法对灵芝子实体和破壁孢子粉的蛋白初提液进行了分离,通过体外免疫反应初步检测了各蛋白质成分的免疫调节活性.小鼠脾淋巴细胞转化试验表明其中有三种灵芝蛋白体外具有较强的促进淋巴细胞增殖的活性,分别命名为LZP-1,LZP-2和LZP-3,其中来自于灵芝孢子粉的LZP-2和LZP-3用量为50μg/ml时,它们体外促进淋巴细胞的增殖率可达(41.3±3.1)%和(38.7±4.8)%,并且呈现出一定的剂量依赖效应,而来自于灵芝子实体的LZP-1促进淋巴细胞的增殖率较低(18.2±3.9%,使用剂量为50μg/ml).SDS-PAGE测得它们的相对分子质量分别为67,000,43,000和45,700.该蛋白有可能是灵芝中具有免疫调节活性的成分之一,具有潜在的临床应用价值.
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重组巴氏杆菌透明质酸合成酶的克隆、表达及活性鉴定
目的:构建重组巴氏杆菌透明质酸合成酶(rPmHAS)原核表达系统,获取高纯度、有活性的rPmHAS.方法:利用大肠杆菌BL-21 pE,pET32a(+)表达重组蛋白,镍亲和柱纯化,夹心竞争EUSA法检测酶活性.结果:western blotting检测显示特异性条带,重组蛋白正确表达,镍亲和柱纯化后得到重组蛋白的纯度可达90%.结论:成功构建了pET2a(+)/rPmHAS重组质粒并实现了目的蛋白高效可溶表达,为PmHAs性质相关研究及单一相对分子质量寡聚透明质酸的合成奠定了基础.
