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重叠延伸PCR.原核表达文献资料
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重叠延伸PCR法克隆重组复合干扰素
目的:用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人工优化的干扰素.重组复合干扰素(consensus interferon,clFN)基因,用原核表达系统对其进行表达,鉴定表达的clFN活性.方法:根据大肠杆茵的偏爱密码子,人工设计cIFN的高表达基因,用overlap PCR法合成cIFN全基因.用基因重组技术构建其原核表达载体pRA-cIFN,在大肠杆茵BL21中进行高效表达,用SDS-PAGE和Western blotting鉴定cIFN表达,用GuHC1阶段透析法进行蛋白变性、复性,用TALON(His)6亲和层析柱进行纯化.用EUSA、MTS比色定量法及血凝抑制试验检测cIFN的免疫活性和生物活性.结果:成功合成了cIFN全基因,其DNA长度与理论长度534 bp相符;用基因重组技术成功构建了cIFN原核表达栽体pRA.cIFN,并用大肠杆茵BL21进行了高效表达,SDS.PAGE和western blotting鉴定结果显示,表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量符合理论值23.3 kDa:用GuHCl阶段透析法成功进行包涵体蛋白的复性.亲和层析法纯化后cIFN的ELISA、MTS比色定量法及血凝抑制试验结果显示,表达蛋白具有明显的cIFN免疫学活性、剂量依赖性PLC/PRF/5细胞增殖抑制作用和HBsAg分泌抑制作用.结论:重叠延伸PCR法是获得重组复合基因的有效简便的方法,我们通过重叠延伸PCR法获得并表达的cIFN具有明显的抗病毒、抗细胞增殖活性.
关键词： 重组复合干扰素 重叠延伸PCR.原核表达 活性鉴定
