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狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组基因的表达与鉴定
目的 构建狂犬病病毒糖蛋白外膜区基因质粒并在大肠埃希菌中表达,为研制狂犬病病毒抗原诊断试剂盒奠定基础. 方法 采用RT PCR方法扩增狂犬病病毒CTN株糖蛋白膜外区基因,目的片段与表达载体PET32a(+)分别经双酶切、胶回收后连接并转化至E.coli BL21(DE3)菌株.阳性重组菌经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析后进行纯化,利用Western blot鉴定其反应原性. 结果 以狂犬病病毒CTN株为模板扩增的糖蛋白膜外区基因片段经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定大小为1 323 bp,与理论值相符;重组质粒经酶切鉴定后转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达的融合蛋白分子质量单位大小约为66.6 ku,与理论值相符;重组菌在IPTG终浓度为1 mmol/L,诱导时间为4h,温度为37℃时蛋白表达产量高.该融合蛋白主要以包涵体形式存在,可被His标签抗体识别. 结论 成功表达了狂犬病病毒糖蛋白膜外区蛋白,该蛋白反应原性良好,为研制狂犬病病毒抗原诊断试剂盒奠定了基础.
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狂犬病病毒CTN株糖蛋白膜外区可溶性高效表达及纯化
目的 探索原核可溶性目的蛋白表达系统对狂犬病病毒糖蛋白膜外区(Ex-GP)进行高效制备及纯化的方法.方法 构建含有融合标签的狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达质粒,筛选可溶性表达条件,采用亲和层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,以获得高效表达的可溶性目的蛋白.结果 成功建立应用原核表达系统高效制备重组可溶性狂犬病病毒糖蛋白膜外区蛋白的方法,获得的目的蛋白具有ELISA抗原活性,推测其构象与天然狂犬病病毒糖蛋白膜外区具有相似性.结论 本研究建立的目的蛋白高效制备方法,操作简便,表达量高,目的蛋白具有抗原性活性,适合目的蛋白规模制备,为深入研究狂犬病病毒糖蛋白生物学功能,解析糖蛋白结构,揭示狂犬病病毒致病机制及开展狂犬病诊断试剂的研发提供了思路.
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狂犬病病毒糖蛋白膜外区密码子优化、原核表达及纯化
目的 有效检测狂犬病毒抗原.方法 本研究利用生物信息学软件对狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区进行分析,采用密码子优化策略将该序列的大肠杆菌稀有密码子优化成大肠杆菌常用密码子.将优化的序列合成与表达载体pET-28a(+) 分别双酶切、胶回收后连接并转化至Rosetta(DE3) 菌株.挑选阳性重组表达菌经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定.同时对佳表达条件进行了研究,重组菌在30℃、IPTG终浓度为0.6 mmol/L、诱导表达6 h时重组蛋白的表达量达到大值.结果 狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区通过密码子优化后能够在大肠杆菌中成功表达,表达产物具有良好的反应原性.结论 该项研究为后续检测狂犬病毒抗原的ELISA试剂盒的研发建立基础.
