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内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒的包装与鉴定
目的:构建内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒载体并包装成重组腺病毒,为下一步基因治疗打下基础.方法:用PCR方法在hENDO基因的5'端引入IL3信号肽、3'端引入弹性蛋白连接肽序列(linker),再与sVEGI基因连接,插入到pCA13腺病毒载体中.用脂质体介导包装出重组腺病毒,PCR法对重组腺病毒进行鉴定.结果:构建完成hENDO-sVEGI融合基因重组腺病毒载体,融合基因包括IL3信号肽、hENDO全长基因、弹性蛋白连接肽序列和sVEGI基因,总长度约1114 bp,经酶切鉴定、序列分析证实克隆序列、插入方向和读码框架均正确.可包装出携带融合基因的重组腺病毒,用TCID50法测定粗制重组腺病毒滴度为2×1011 TCD50/L.结论:成功构建了hENDO-sVEGI融合基因,连接肽序列使两蛋白空间构象不受影响,IL3信号肽保证蛋白可被分泌至胞外.完成携带融合基因的重组腺病毒的包装与鉴定,为进一步开展肿瘤基因治疗研究奠定了基础.
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抗肝癌人源化Diabody在大肠杆菌中的可溶性表达及活性鉴定
目的:构建人源化抗肝癌双价抗体,并实现其在大肠杆菌中的可洛性表达.方法:缩短人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的连接肽为5肽,构建(hscFv25)2基因,克隆入原核表达载体后,转化入大肠杆菌表达,并纯化目的蛋白,细胞ELISA、免疫组织化学法检测其生物活性.结果:目的基因在大肠杆菌中得到了可洛性表达,纯化蛋白的相对亲和力比亲本抗体提高了10倍左右,对肝癌组织切片的免疫组织化学染色呈强阳性,阳性率为75%.结论:成功制备了人源化抗肝癌双价抗体,该抗体具有较高的亲和力,为进一步的临床研究奠定了基础.
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磁性分离酶标技术检测C -肽
C-肽或连接肽(C-P)由胰岛B细胞分泌到血液中,并与胰岛素以等克分子方式释放,且不被肝细胞摄取,半衰期比胰岛素长2倍多,故C-P的测定对评价B细胞功能和糖尿病治疗方式的选择有参考价值.
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078单链抗体的改进--ScFv多聚体
ScFv多聚体是通过将单链抗体的连接肽缩短至12个氨基酸以下而构成的一种新型小分子抗体,由单链抗体聚合为二聚体、三聚体等形式,使抗原结合价增加、亲和力得到提高、功能多样,具有广阔的应用前景.本文对该新型小分子抗体连接肽的设计、性能、表达及应用作一综述.
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白喉毒素-(Gly4Ser)2-α促黑素重组蛋白的研究
白喉毒素(DT)是由白喉棒状杆菌所产生的分子量为58 kD的外毒素,它在胰蛋白酶的作用下可降解为A和B两个片段, B片段能与敏感宿主细胞的特异受体结合并能将A片段转位到胞浆,A片段具有核糖体依赖的酶活性,它通过灭活真核细胞的肽链延长因子Ⅱ来阻断细胞蛋白合成.
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C肽与2型糖尿病慢性并发症的相关性
C肽又称连接肽,是胰岛素原转变为胰岛素过程中的裂解产物.长期以来一直认为C肽没有生物活性,只能用于评估糖尿病患者残留的内源性胰岛素分泌功能,但近年来大量的研究显示C肽具有多种生物活性,特别在改善血管及神经功能方面发挥着重要作用.
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连接肽在融合蛋白设计中的选择及应用
融合蛋白的设计中,经常需要用链接肽将不同功能的蛋白进行连接融合.连接肽的设计和选择对融合蛋白的表达、稳定性及功能活性至关重要.文章将常见的两种连接肽分为柔性(Flexibility)和刚性(Rigidity)进行比较说明.其中柔性连接肽即成柔软线性的一类易弯折的氨基酸序列,常见为(GGGGS)n重复序列(n=3~4);刚性连接肽即成稳固螺旋结构的一类长度固定的氨基酸序列,常见为(EAAAK)n重复序列(n=2~5).设计连接肽时应考虑长度、氨基酸成分、亲水性、构象、柔韧性及电荷等因素.连接肽中的氨基酸组成对柔性连接肽影响较大,而氨基酸排列影响着刚性连接肽的结构.文章结合近年来融合蛋白设计中两种常用连接肽的相关报道进行阐述,为连接肽的研究提供参考.
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幽门螺杆菌融合蛋白UreB-Omp11在大肠杆菌中的表达与纯化
近年来,研究者发现了多种Hp的有效保护性抗原成分,UreB、Omp、Hsp、NAP等,其中尿素酶、外膜蛋白等是人们研究的焦点.但它们单独免疫动物时,获得的免疫保护效果均不理想,为克服单一抗原分子诱导的免疫保护水平偏低的问题,本研究用重叠延伸PCR法将H.pylori郑州分离株MELHP27的ureB与omp11两个基因进行融合,中间加入弹性蛋白连接肽编码序列为接头,并通过设计合适的酶切位点,将融合蛋白插入原核表达载体pMAL-c2X中,使其融合表达,为Hp多价抗原基因工程疫苗的研究奠定基础.
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非胰岛素依赖型糖尿病患者血清ICA与C肽的相关性分析
胰岛细胞抗体(ICA)是1型糖尿病的重要血清学标志之一.C肽又称连接肽,是胰岛β细胞的分泌产物,其与胰岛素有一个共同的前体-胰岛素原.一个分子的胰岛素原经酶切后,裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C肽.2009年1~12月,我们检测了非胰岛素依赖型糖尿病患者血清ICA及C肽水平,现分析二者的相关性,探讨其与非胰岛素依赖型糖尿病的关系.
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单链双价抗体连接肽的优化设计
以单链抗体为元件构建的基因工程双价抗体分子近年来在肿瘤的治疗方面显示出良好的应用前景,但双价单链抗体分子的亲和性及抗肿瘤活性分别较衍生因子的功能及活性有所变化.合适的连接肽可以赋予双价单链抗体更适于临床应用需求的生物学活性,如何选取或设计连接肽是构建单链双特异性抗体的关键步骤.在分子量子化的模型基础上,运用同源模建的方法建立单链抗体分子间结构与功能的关系模型,采用改进的遗传算法把连接肽的设计看作为方程的求解问题,改善算法的搜索能力、搜索效率和收敛性能,设计全局优的连接肽.双价单链抗体连接肽的设计是在充分利用生物信息学的基础上,探索具有不同功能域的复合蛋白质以及连接肽的设计,为恶性肿瘤的靶向多功能基因治疗提供科学依据,并为寻找有效的治疗因子提供研究方向.
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抗骨形成蛋白单链抗体的构建与表达
目的:构建抗骨形成蛋白单链抗体并获得表达.方法:应用一段人工合成的含15个氨基酸的连接肽,采取亚克隆技术,将一株鼠抗BMP单克隆抗体的重链可变区(VH)的N端和轻链可变区(VL)的C端连接起来;将连接产物克隆入融合蛋白表达载体pEGX-4T-l,在大肠杆菌JM109中进行表达.结果:构建的单链抗体(ScFv)全长705 bp,并获得融合表达产物约52×103u.结论:亚克隆方法是一种构建单链抗体快速、简便、可靠的方法.
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化学发光法检测血清C肽水平及其临床应用
C肽又称连接肽(C-peptide),它与胰岛素(INS)都是由胰岛β细胞分泌并从胰岛素原分裂而成的等摩尔肽类物.C肽在非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)病人的临床诊断及疗效观察方面有重要意义,国内现多采用放射免疫法(RIA)测定C肽.
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抗乙型肝炎表面抗原单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及鉴定
从抗HBsAg鼠单抗的杂交瘤细胞提取RNA,经反转录得到cDNA,进一步扩增得到鼠重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),按VH-linker-VL的结构将VH、VL基因拼接成单链抗体(scFv)基因;经测序正确后进一步构建了表达重组体p26HBSc并在E. coli中表达,得到一约30kD的外源蛋白;纯化后经ELISA检测与HBsAg 有较高的亲和力活性,为下一步的人源化改造奠定了基础.
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热休克蛋白HSP65嵌合表达系统的构建和表达
设计一条含(GlySer)3连接肽的引物,从BCG经PCR得到HSP65-Linker的基因片段.将该基因定向克隆入原核表达载体pET42b(+),用大肠杆菌BL21(DE3)转化,构建了pET42-LHSP65的嵌合表达载体.DNA测序正确后经IPTG诱导表达,得到可溶性目的蛋白,Western-blot也证实了此重组蛋白可与抗HSP65发生特异性免疫反应.此重组体的构建为进一步探索HSP65的免疫佐剂功效奠定了基础.