SELDI技术研究白喉毒素对豚鼠肝脏组织蛋白质组的毒理作用

作为蛋白质组学新的研究技术,表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)具有快速、简单和灵敏等优点,它不仅可在肿瘤诊断中用于发现标志物、观察治疗效果,还可用于研究蛋白质的修饰、相互作用、信号传导和酶促调节等[1-3],从而实现在蛋白质水平的大规模功能研究.目前该技术主要应用于肿瘤的早期诊断,而在毒理学方面的应用几乎为空白.白喉毒素(DT)作为融合靶向性抗肿瘤药物[4-6],也是近期的研究热点.为拓展SELDI技术在毒理学的应用,我们使用该技术,研究了DT染毒豚鼠与正常豚鼠肝脏组织蛋白质组的差异,从而探讨DT的毒理作用和可能的作用机制.

应用白喉毒素-IL-2融合蛋白研究Q126D突变对IL-2功能的影响

IL-2是一非常重要的由133个氨基酸组成的TH1细胞因子,从N端到C端依次为上、上后再下、下的4个螺旋结构.位于C端的后一个螺旋结构在其与相应受体的β、γ亚基的结合中起重要作用.

白喉毒素基因序列染色体整合质粒的构建

目的构建白喉杆菌染色体整合质粒，建立使外源基因置换白喉毒素基因的方法。方法 PCR方法，寡核苷酸合成方法及其他分子克隆技术。结果使用以上方法准确制备了所需特定碱基序列位置的2个与白喉毒素基因相关的染色体同源片段，插入pG+host5后又引入转录终止子和抗生素抗性基因，从而产生具有可接入外源基因并与白喉杆菌染色体进行双交换同源重组能力的质粒pLB23。用此质粒对白喉杆菌PW8进行了染色体整合，获得了其遗传变异株。结论所构建的整合质粒能够用于白喉杆菌染色体的同源重组，实验为将外源基因引入白喉杆菌染色体进行表达奠定了基础。

构建靶向毒素血管内皮生长因子抗体-白喉毒素突变体

目的探讨以血管内皮生长因子(VEGF)抗体为导向,白喉毒素突变体(CRM9)作效应部分,构建靶向毒素VEGF抗体-CRM9,为直接杀伤肿瘤细胞寻找新的药物.方法应用异型双功能连接剂甲基丙烯酸甲酯丁二烯苯乙烯三元共聚物(MBS)连接兔抗人VEGF多抗和CRM9,制备成新的构建蛋白,Sephacryl S-300分离纯化后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明二者的结合情况.对构建蛋白抗体活性采用酶联免疫法检测,生物毒性应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法检测.结果构建蛋白通过分离并电泳后,出现明显增粗的分子量为116 000新条带,位于CRM9和VEGF条带前方.构建的蛋白结合体中抗体活性检测,VEGF抗体与CRM9按1:1制备的蛋白结合体,抗体活性与VEGF抗体对照差异无统计学意义(P＞0.05),按1:5和1:8两种比例制备的蛋白结合体,抗体活性降低与VEGF抗体对照差异有统计学意义(P＜0.01).构建的蛋白结合体中CRM9毒性检测,VEGF与CRM9按1:1比例制备蛋白结合体杀伤效果与空白对照组差异有统计学意义(P＜0.01),与CRM9组差异无统计学意义(P＞0.05),CRM9组杀伤效果与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论MBS能将VEGF抗体与CRM9连接构建成新的蛋白结合体,结合体中CRM9生物毒性和VEGF抗体活性不变.这将为进一步的免疫毒素抗肿瘤的各项研究奠定了基础.

白喉毒素氨基端389个氨基酸-人碱性成纤维细胞生长因子靶向毒素的克隆表达及对人晶状体上皮细胞毒性研究

目的 为阻止白内障术后囊膜混浊寻找物质基础.方法 提取灭活的白喉杆菌DNA和12周胎脑皮质RNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增出编码白喉毒素氨基端389个氨基酸(DT389)的基因片段及编码18kd人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的基因全序列,将两基因先后插入表达载体中,构建含有DT389-hbFGF融合基因的表达质粒,测序后,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化鉴定表达产物,噻唑蓝(MTT)试验检测其对体外培养人晶状体上皮细胞(HLECs)的毒性作用,流式细胞术鉴定不同剂量融合毒素所致HLECs成活率及细胞死亡形式.结果 扩增得到DT389基因片段及hbFGF全基因序列;构建了DT389-hbFGF融合基因的原核表达载体并成功表达;表达的融合蛋白对HLECs有明显的毒性作用并在一定范围内呈明显剂量依赖性,半数致死量为3.8×10-11mol/L,所致细胞死亡方式主要以凋亡为主.结论 DT389-hbFGF免疫毒素克隆表达的成功为药物促晶状体上皮细胞的凋亡、抑制后发障的研究奠定了物质基础.

亲和标记DAB389 (Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白的构建、表达及纯化

目的:构建含有亲和标记His-tag的DAB389 (Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白,便于融合蛋白质的纯化.方法:利用含有His-tag序列、Factor Xa酶切识别序列、白喉毒素N端序列的基因作上游引物,含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2互补序列基因作下游引物,以pET28a/DAB389(Gly4Ser)2EGF为模板,PCR扩增目的基因片段,并插入到原核表达载体pET28a中,构建了重组表达载体pET28a/亲和标记DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,融合蛋白在BL21(λDE3)中以可溶形式表达,通过硫酸铵盐析、亲和层析纯化、脱盐、Factor Xa酶切得到重组蛋白纯品.结果:扩增的片段与理论值一致,序列分析正确;目的蛋白表达量约占菌体总蛋白量的30.6%;纯化得到纯度为94.36%的重组蛋白.结论:成功构建了含有His-tag的DAB389 (Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白,减少了纯化步骤,为进一步研究重组毒素、简便纯化途径奠定基础.

不同免疫球蛋白启动子控制的白喉毒素A链基因对淋巴瘤细胞的抑制作用

目的 比较免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子和免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的白喉毒素A链基因对淋巴瘤细胞生长抑制.方法 将白喉毒素A链基因或细菌β半乳糖苷酶基因与免疫球蛋白启动子/增强子相连构建成白喉毒素A链真核表达载体pcDNA3IgκDTA、pcDNA3IgHDTA或细菌β半乳糖苷酶真核表达载体pcDNA3IgκLacZ、pcDNA3IgHLacZ.由脂质体介导将质粒转染至产或不产免疫球蛋白的真核细胞中,检测β半乳糖苷酶基因在不同细胞中的表达水平,并进一步检测白喉毒素A链基因的表达对转染细胞的生长抑制作用.结果 由免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子或免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的β半乳糖苷酶基因只能在产免疫球蛋白(κ轻链型)细胞株CA46中表达.当β半乳糖苷酶基因与质粒pcDNA3IgκDTA或pcDNA3IgHDTA共转染时,β半乳糖苷酶基因的表达只在CA46细胞中被抑制.质粒pcDNA3IgκDTA、pcDNA3IgHDTA的表达均能明显抑制CA46细胞的生长,而对照质粒pcDNA3IgκLacZ或pcDNA3IgHLacZ对CA46细胞则无明显作用,并且pcDNA3IgκDTA的抑制作用较pcDNA3IgHDTA更强.结论 由免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子或免疫球蛋白重链启动子/增强子控制的白喉毒素A链基因的表达能特异性地杀伤产免疫球蛋白(κ轻链)的肿瘤细胞.并且免疫球蛋白κ轻链启动子/增强子较免疫球蛋白重链启动子/增强子有更强的启动转录活性.

融合蛋白DT389-hIL-13的克隆表达及其抗胶质瘤作用的初步研究

目的构建白喉毒素N端389个氨基酸(DT389)与人白细胞介素13(hIL-13)的融合蛋白DT389-hIL-13,并检测其生物学活性.方法通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到hIL-13的cDNA,将序列正确的hIL-13及DT389的cDNA片段串联插入表达载体pET30a,构建表达质粒pET30a/DT389-hIL-13,并对表达产物进行鉴定及初步纯化.该融合蛋白加入培养的U251胶质细胞中,应用MTS方法检测其对多型性胶质母细胞瘤细胞的杀伤作用.结果得到序列正确的融合蛋白DT389-hIL-13的表达质粒pET30a/DT389-hIL-13,该质粒在大肠杆菌成功表达,经初步纯化后,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳及Western 印迹分析表明,该融合蛋白对白喉毒素多克隆抗体及hIL-13多克隆抗体都有很好的免疫反应性,相对分子质量约为55 000;进一步活性检测发现,该融合蛋白对多型性胶质母细胞瘤细胞系U251的生长有较强的抑制作用,且作用存在剂量相关性,其半数抑制浓度(IC50)约为5×10-11mol/L.结论成功构建了融合蛋白DT389-hIL-13的表达质粒,在细胞水平对表达产物进行了初步的活性检测,为进一步研制特异性的抗胶质瘤药物打下了基础.

静脉注射用免疫球蛋白的应用及其机制

免疫球蛋白(Ig)用于治疗人类疾病的历史可以追溯到1890年,Behring利用白喉毒素抗血清治疗白喉.1970年,伴随血浆分离技术发展出现静脉注射用免疫球蛋白(intravenousimmune globulin,IVIg)制剂[1].

白喉毒素-(Gly4Ser)2-人表皮生长因子融合蛋白的纯化及其特异性细胞毒性研究

白喉毒素(Diphtheria Toxin,DT)是由感染β噬菌体基因组的白喉棒状杆菌所产生的分子量为58342da的外毒素,它通过灭活真核细胞的肽链延伸因子Ⅱ(EF-2),阻断细胞蛋白合成,导致细胞死亡.毒素经胰蛋白酶水解分成193个氨基酸残基的A片段和342个氨基酸残基的B片段,A片段分子量为22kD,位于毒素氨基末端,它进入细胞内可以催化ADP-核糖基化,灭活真核细胞的延长因子Ⅱ(EF-2);B片段分子量为38kD,位于羧基末端,由跨膜、转位、受体结合区组成.表皮生长因子是一种多功能的细胞因子,可由多种细胞产生,在一些肿瘤细胞表面(骨髓瘤、原发性肝癌、前列腺癌、鳞状上皮癌)EGF受体呈过度表达,显著高于毗邻组织的正常细胞.

重组DT/bFGF融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的构建重组DT/bFGF融合蛋白表达载体,制备高纯度的DLF融合毒素.方法PCR扩增DT389和bFGF的编码DNA序列,经酶切和连接,克隆至表达载体pET-30a,转化E.coli BL21(DE3),鉴定阳性克隆菌落,经IPTG诱导表达融合蛋白DLF,镍离子螯合层析纯化,用Western blot分析其抗原性.结果测序表明,插入片段可编码含545个氨基酸残基的融合蛋白DLF.SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白可在大肠杆菌中表达,其表达量约占菌体总蛋白的20%,表达形式主要为包涵体.纯化后纯度达90%以上.Western blot证实,该融合蛋白同时具有DT和bFGF两种抗原性.结论已成功构建DT/bF-GF表达载体,并获得较纯的DLF融合毒素.

白喉毒素无毒突变体H21G蛋白的分泌性表达及纯化

目的 原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础.方法 以pET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至pET22b载体中,构建重组原核表达质粒pET22b-H21G,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组H21G蛋白分泌性表达.重组蛋白经渗透压休克,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6FF(high sub)疏水层析纯化后,使用还原/非还原SDS-PAGE和HPLC法分析纯化蛋白的纯度,窄范围等电聚焦分析其等电点,MALDI-TOF质谱法分析其相对分子质量,N-末端测序法鉴定N-末端氨基酸序列.结果 重组原核分泌性表达质粒pET22b-H21G经双酶切(Nco Ⅰ和Xho Ⅰ)和测序证明构建正确;目标蛋白以可溶形式存在于宿主菌周质间隙,表达量为10％～15％;经纯化后,重组蛋白纯度达95％以上,等电点在4.55 ～6.20之间,相对分子质量和N-末端氨基酸序列均与白喉毒素相符合.结论 成功分泌性表达并纯化了重组白喉毒素无毒突变体H21G蛋白,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定了基础.

A群脑膜炎球菌多糖-白喉毒素无毒变异体CRM197结合物的制备及其初步评价

目的 制备A群膜炎球菌多糖(Group A meningococcal polysaccharide,GAMP)-白喉毒素无毒变异体CRM197(Cross-reactive material 197)结合物,并分析其理化性质及免疫学特性.方法 白喉棒状杆菌C7 M1菌株经发酵培养表达CRM197,表达产物经DEAE-4FF层析柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.用溴化氰(CNBr)活化GAMP,己二酰肼(ADH)为连接剂,在碳二亚胺(EDAC)催化下将GAMP与CRM197共价结合,制备GAMP-ADH-CRM197结合物,经Sepharose 4FF层析柱纯化后,进行各项生化检测,采用免疫双扩散检测结合物的抗原性,将结合物皮下注射ICR小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP的抗体滴度,分析其免疫原性.结果 发酵培养20 h时,菌液上清中的CRM197蛋白表达量高；CRM197以分泌形式表达,纯化后纯度达95％以上,可与白喉类毒素单抗发生特异性反应；GAMP-ADH-CRM 197结合物各项生化指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求,与A群流脑诊断血清形成明显的沉淀线,结合物诱生的多糖特异性抗体滴度显著高于多糖组和混合物组.结论 成功制备了GAMP-ADH-CRM197结合物,其具有良好的抗原性和免疫原性,为以CRM197为蛋白载体制备脑膜炎球菌结合疫苗奠定了基础.

白喉毒素无毒变异体CRM197的表达及其载体作用

目的 表达白喉毒素无毒变异体CRM197,并考察其载体作用.方法 利用基因工程技术在大肠杆菌B121(DE3)中表达CRM197用金属镍离子亲和层析纯化;以重组CRM197为蛋白载体,在EDAC的作用下,与活化的A群脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP)结合,制备GAMP-rCRM197结合物,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法测定血清中A群脑膜炎球菌多糖特异性IgG抗体,并分析其免疫原性.结果 重组CRM197昕在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的25%左右;Western blot证明重组CRM197具有良好的反应原性;各针接种后,结合物诱生的多糖特异性IgG水平均显著高于GAMP组和GAMP+rCRM197混合物组,具有较强的免疫原性;多次接种产生了免疫增强效应,重组CRM197具有载体蛋白的作用.结论 已在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组CRM197,以纯化的重组CRM197作为载体制备的GAMP-rCRM197结合物具有良好的免疫原性,为以重组CRM197为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础.

068重组葡萄球菌株诱生白喉抗毒素

以非致病性菌株表达目的抗原,可望诱导有效的免疫应答,其中以革兰阳性的木糖葡萄球菌、肉质葡萄球菌尤为安全、高效.它们与金黄色葡萄球菌有低水平的DNA同源性,但却不产生有致病力的毒素、溶血素、凝集素、蛋白A等,可作为抗原的活载体,有效表达全部或部分抗原成分,诱导持久的体液免疫反应.本实验旨在研究毒性蛋白上某一定义完整的结构域能否被表达在这两种菌株表面,它们能否在小鼠体内诱生中和抗体.已知,白喉毒素(DT)的382～535氨基酸片段是结构完整的区域,为受体结合域DTR.

Hib-CRM197多糖结合疫苗经皮免疫诱导的抗Hib抗体应答

经皮免疫(TCI)是一种新型免疫方法,英国国立生物制品标准和控制研究所Mawas等检测了TCI b型流感杆菌(Hib)-白喉毒素(DT)交叉反应物质(CRM197)多糖结合疫苗加霍乱毒素(CT)或大肠杆菌不耐热肠毒素突变体(LTK63和LTR72)诱导的抗Hib和DT抗体应答.

003 高纯度霍乱毒素突变体E112K能诱导对白喉毒素的保护性肺粘膜免疫

007 以修饰的白喉毒素和重组鸭乙型肝炎核心抗原为载体的B族链球菌多糖结合疫苗的临床前评价

059 O139型霍乱弧菌荚膜多糖-重组白喉毒素突变体结合疫苗的制备及免疫原性

G17-白喉毒素嵌合蛋白的表达 、纯化和免疫原性初步研究

目的 构建胃泌素多肽G17-白喉毒素A亚单位(diphtheria toxin subunit A,DTA)嵌合蛋白,并初步研究其免疫原性.方法 用酶切法将编码G17的基因与DTA基因连接后,插入载体Pet11c,并在大肠埃希菌BL21中表达.先后用阴离子交换色谱法和分子排阻色谱法对表达的目的蛋白进行纯化.用纯化的G17-DTA免疫NIH小鼠,并用ELISA检测小鼠抗G17抗体.结果 构建的G17-DTA嵌合蛋白可在大肠埃希菌中高效表达,表达量达0.5～0.6 mg/ml菌液.经2次纯化后,G17-DTA的纯度可达95％.纯化的G17-DTA在小鼠中诱生了抗G17抗体.结论 构建的G17-DTA嵌合蛋白能在大肠埃希菌中表达,而且在小鼠中具有免疫原性.