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白喉杆菌培养基相关质控标准探讨
目的 建立白喉杆菌培养基的相关质控标准.方法 分别制备氨氮含量≥1.8 g/L和＜1.8 g/L的白喉杆菌培养基用于白喉杆菌大罐培养,采用t检验对培养结果进行统计学分析,确定佳培养基配方.按确定的培养基配方制备15批白喉杆菌培养基用于白喉杆菌大罐培养,检测培养收获的白喉毒素絮状单位,并分析培养基氨氮含量与白喉杆菌产毒间的相关关系.配制15批15％ ～20％的麦芽糖溶液,分别作为补料于白喉杆菌培养过程中加入大罐,检测培养收获的白喉毒素絮状单位,并分析麦芽糖溶液浓度与白喉杆菌产毒间的相关关系.结果 采用氨氮含量≥1.8 g/L的培养基培养收获的白喉毒素絮状单位明显高于采用氨氮含量＜1.8 g/L的培养基培养(t=0.5635,P＜0.05).在确定的氨氮含量范围(1.8 ～2.0 g/L)内,培养基氨氮含量与收获的白喉毒素絮状单位呈线性正相关(r=0.52).当麦芽糖溶液浓度为15％ ～ 20％时,麦芽糖溶液浓度与收获的白喉毒素絮状单位呈线性负相关(r=-0.53).结论 白喉杆菌培养基氨氮含量控制在1.8 ～2.0 g/L,补料麦芽糖溶液浓度控制在15％ ～20％时,大罐培养收获的白喉毒素絮状单位可达到规程要求.
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检测白喉毒素特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法的建立
目的 建立检测白喉毒素(diphtheria toxin,DT)特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法.方法 用MEM培养液对DT进行不同倍数的预稀释,用目测法确定DT的适预稀释倍数.用建立的方法检测以适预稀释倍数稀释的DT,以确定该法的灵敏度和细胞病变半数抑制浓度(IC50),同时绘制剂量-反应曲线以验证该法的重复性.用建立的方法于不同pH、盐浓度或蔗糖浓度条件下检测DT,计算DT回收率以验证该法的耐用性.结果 目测法确定的DT适预稀释倍数为106倍.建立的方法的平均检测灵敏度为(6.01±1.44)×10-5 lf/ml DT,细胞病变半数抑制率对数值(log IC50)范围为5.02 ～ 5.82,变异系数为5.82％,该法具有较好的重复性.用建立的方法检测不同条件下的DT显示,DT的平均回收率为93.7％ ～ 110.4％,该法具有较好的耐用性.结论 Vero细胞/MTr法可用于检测DT特异性细胞毒性.
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白喉毒素-(Gly4Ser)2-α促黑素重组蛋白的研究
白喉毒素(DT)是由白喉棒状杆菌所产生的分子量为58 kD的外毒素,它在胰蛋白酶的作用下可降解为A和B两个片段, B片段能与敏感宿主细胞的特异受体结合并能将A片段转位到胞浆,A片段具有核糖体依赖的酶活性,它通过灭活真核细胞的肽链延长因子Ⅱ来阻断细胞蛋白合成.
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白喉毒素抗肿瘤作用研究进展
白喉毒素(Diphtheria toxin,DT)是白喉杆菌产生的细菌外毒素,它可以使机体产生严重的中毒反应,1～2个分子就可以杀灭一个细胞.随着医学科学的进展,目前对白喉毒素的结构和性质都已经很清楚,并且正在利用其毒性反应进行抗肿瘤治疗.本文对近年来这方面的进展进行简单的综述.
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四环素调控白喉毒素基因的重组逆转录病毒载体的构建
将毒素基因导入肿瘤细胞内是肿瘤基因治疗一个较有前景的手段[1].白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由白喉杆菌分泌的一种单链多肽毒素,大多数哺乳类细胞均存在这种毒素的受体,其A片段(DTA)毒力特别强,它能催化不可逆转的ADP核糖酰基化,使肽链延长因子Ⅱ失活,从而抑制宿主细胞蛋白合成[2].Gossen等[3]提出了可调控型高表达系统(Tet系统),这为毒素基因治疗肿瘤开辟了新途径.Tet系统可分为 Tet-On和Tet-Off系统,前者的基因表达是在四环素加入后激活,而后者则是在四环素浓度逐渐降低的情况下激活.我们构建携带四环素系统调控的DTA基因的逆转录病毒载体,为进一步探讨肺癌的基因治疗奠定基础.
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PGL3-DF3-DTA对DF3阳性人乳腺癌细胞的体内杀伤作用及机制探讨
将36只4周龄雌性SPF级裸鼠随机分为实验组、空载体组、空白对照组、阴性对照组四组,每组各9只.将人乳腺癌MCF-7细胞接种于前三组裸鼠皮下,MDA-MB-231细胞接种于阴性对照组裸鼠皮下.待成瘤后,将重组表达载体PGL3-DF3-DTA和PGL3-DF3多次、多位点注射入相应裸鼠移植瘤内.观察肿瘤体积变化情况.并于接种后2、5、7周分批处死动物,用免疫组化技术检测瘤组织中LYVE-1、F8、Ki-67、bax、Bcl-2蛋白的表达.结果 从接种后3周起,实验组裸鼠肿瘤体积明显小于其他三组;从接种后5周起实验组裸鼠瘤细胞LYVE-1、F8、 Ki-67、Bcl-2表达水平降低,bax表达水平升高.认为重组表达载体PGL3-DF3-DTA能对DF3阳性的乳腺癌细胞产生特异性杀伤作用.其机制可能与PGL3-DF3-DTA下调LYVE-1、F8、 Ki-67、Bcl-2表达及上调bax表达有关.
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白喉毒素竞争ELISA的定量检测
目的 制备白喉毒素的单克隆抗体并建立定量检测白喉毒素的竞争ELISA方法.方法 用白喉毒素免疫BALB/c小鼠,通过常规方法融合、间接ELISA筛选分泌白喉毒素特异性抗体的杂交瘤阳性细胞株,有限稀释法克隆3次～4次,用稳定分泌抗白喉毒素特异性抗体的阳性细胞株扩大培养,制备腹水.以含白喉毒素单克隆抗体的腹水进行竞争ELISA定量检测白喉毒素.结果 筛选出6株分泌白喉毒素特异性抗体杂交瘤阳性细胞株,应用1株单克隆抗体,进行的竞争ELISA定量检测白喉毒素的检测范围为3.2 ng/ml～ 50 000 ng/ml.结论 用制备抗白喉毒素的单克隆抗体,建立了白喉毒素竞争ELISA定量检测的免疫检测方法.
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白喉毒素及其抗癌作用的研究状况
白喉毒素(Diphtheriatoxin,DT)是白喉棒状杆菌产的细菌外毒素,使机体发生严重中毒反应.随着医学研究的进展,人们对白喉毒素的结构及性质已清楚,并应用其毒性作用进行抗癌研究,现综述如下.
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靶向DF3的白喉毒素A链基因对乳腺癌细胞的杀伤作用
目的 探讨白喉毒素A链(DTA)基因在DF3/MUC1启动子调控下的杀伤作用.方法 构建含人乳腺癌DF3启动子和白喉毒素A链基因的表达载体pGL3-DF3-DTA,转染DF3阳性的乳癌细胞MCF-7,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测DTA基因的表达;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长活性;免疫组织化学法和流式细胞术检测细胞凋亡.结果 酶切和测序表明获得了与预期结果相一致的pGL3-DF3-DTA真核表达载体.转染MCF-7细胞后,RT-PCR检测到了249 bp的DTA mRNA片段.与对照组比较,转染pGL3-DF3-DTA的MCF-7细胞生长受到了抑制,流式细胞术检测到的凋亡率达39.43%,而对照组仅有0.28%.结论 pGL3-DF3-DTA可对DF3阳性的乳癌细胞产生特异性的杀伤,对乳腺癌的基因治疗有潜在的应用价值.
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不同剂量白喉毒素对野生型听力成熟小鼠耳蜗结构及听功能的影响
目的 观察不同剂量白喉毒素对野生型听力成熟小鼠的耳蜗结构及听功能的影响,为建立白喉毒素受体介导的细胞敲除系统动物模型提供参考.方法 4周龄C57BL/6J小鼠30只随机分为50 ng/g组、100 ng/g组和对照组,每组10只;其中50 ng/g组和100 ng/g组小鼠分别单次腹腔注射白喉毒素50 ng/g、100 ng/g,对照组小鼠单次腹腔注射等量生理盐水,注射后7天观察两组动物的一般情况,并记录小鼠ABR反应阈,观察小鼠内外毛细胞、螺旋神经节神经元.结果 在白喉毒素注射后第7天,各组动物情况良好,无明显体重下降,中耳腔无积液.50 ng/g组小鼠2、8、32 kHz ABR反应阈分别为57.5±2.74、20.83±2.04、45.83±2.04 dB SPL,与对照组比较(分别为56.25±2.31、20.0±3.78、49.38±6.78 dB SPL)差异无统计学意义;内、外毛细胞损失率分别为0.8%±0.5%、1%±0.6%;对照组分别为0.3%±0.5%、0.4%±0.3%;螺旋神经节神经元SGN密度为39.45±3.65个/105 μm2、对照组为41.03±3.73个/105 μm2,均未见明显细胞缺失.100 ng/g组小鼠2、8、32 kHz ABR反应阈分别为85±3.54、63±4.47、90±0 dB SPL,较前两组显著升高(t=19.62,P<0.001),内、外毛细胞损失率分别为0.5%±0.1%、10.7%±0.3%,损伤严重,底、中、顶回缺失达10%(t=42.219, P<0.001);SGN密度为25.55±3.66个/105 μm2,平均减少38%,与对照组相比差异有显著统计学意义(t=10.985,P<0.001).结论 100 ng/g白喉毒素注射能引起听力成熟野生型C57BL/6J小鼠外毛细胞及螺旋神经元的损伤.
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特异性结合血管内皮生长因子受体2的融合毒素
目的制备特异性结合血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2)的融合蛋白,阻断新生肿瘤血管内皮细胞和某些VEGFR-2阳性肿瘤细胞内的蛋白合成,引起细胞死亡.方法运用基因定点突变技术,制成VEGF D63A、E64A、E67A突变体.利用这个可以和VEGFR-2特异性结合的VEGF突变体,代替白喉毒素上的受体结合区,制成了特异性结合VEGFR-2的融合蛋白.结果以去除了受体结合区的DT391作为对照,以VEGFR-2阳性肿瘤细胞做实验,验证了这个融合毒素对VEGFR-2阳性细胞的选择性杀伤作用.结论制备了特异性杀伤血管内皮生长因子受体2阳性细胞的融合毒素.
关键词： 白喉毒素 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子受体 融合毒素 -
DT389-hbFGF免疫毒素的克隆与表达
目的:构建含有白喉毒素氨基端389个氨基酸的片断(DT389)人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的融合蛋白(DT389-hbFGF)表达质粒并表达该免疫毒素,为阻止白内障术后囊膜混浊寻找物质基础.方法:提取灭活的白喉杆菌DNA和12 wk胎脑皮质RNA,应用PCR技术分别扩增出编码DT389的基因片段及编码18kDahbFGF的基因全序列,将两基因先后插入表达载体中,构建含有DT389-hbFGF融合基因的表达质粒,测序后,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化并鉴定表达产物.结果:扩增后得到DT389基因片段及hbFGF全基因序列;构建了DT389-hbFGF融合基因的原核表达载体并成功表达.结论:DT389-hbFGF免疫毒素克隆表达的成功为药物抑制后发性白内障的研究奠定了物质基础.
关键词： 免疫毒素 白喉毒素 碱性成纤维细胞生长因子 -
白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达
目的：构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction, PCR)扩增 CRM197基因,插入表达载体 pET11b 中,构建重组原核表达质粒 pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3) pLysS, IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致；表达的重组蛋白相对分子质量约58000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。
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肺炎球菌表面蛋白A不影响小鼠对百白破疫苗的免疫应答
肺炎球菌表面蛋白A( PspA)是一种抗肺炎链球菌的构成蛋白疫苗的很有希望的候选物。之前我们已经表明,全细胞百日咳疫苗( wP )对于PspA是一种很好的佐剂,在小鼠中诱导抗肺炎球菌感染的保护性应答。在巴西, wP 与白喉、破伤风类毒素( DTPw)及氢氧化铝(明矾)佐剂一起施用于儿童。在小鼠中P spA5-DTP 。的单一皮下注射剂量(配方包含得自进化支5的PspA和新一代DTPw,并含有低剂量的百日咳杆菌脂多糖和明矾)诱导高水平的全身P spA5抗体,并针对两种不同的呼吸道致命性肺炎球菌菌株攻击提供保护。在这里,我们评估针对了小鼠接种P spA5-DTP 。后对P spA5的黏膜免疫应答,以及对 DTP 抗原的免疫应答。 P spA5-DTP 。于小鼠皮下免疫,在呼吸道中诱导了高水平的抗-PspA5 IgG而不是IgA。另外观察到,接种后小鼠与对照组小鼠在受到攻击后,细胞涌入呼吸道黏膜的情况没有差异。接种DTP 。或P spA5-DTP 。的小鼠中循环的抗百日咳、抗破伤风和抗白喉抗体的水平是等价的。 DTP 。和 P spA5-DTP 。诱导的抗体在中和Vero细胞中白喉毒素的细胞毒时显示出相似的能力。此外,与P spA5组合丝毫不影响小鼠对百日咳杆菌和破伤风毒素的预防。我们的研究结果支持联合P spA-DTP疫苗的方案。
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白喉毒素超滤浓缩后膜通透性恢复试验的研究
应用超滤浓缩技术对白喉毒素培养液进行澄清过滤和超滤浓缩,已经早已为生产厂家所使用.但是,超滤膜的通透性下降很快,使膜的使用期限大大缩短,生产成本较高.因此在试验过程中,注重摸索超滤过程的中间控制以及超滤结束后的清洗方法,特别是使用0.5 mol/LNaOH+200ppm次氯酸钠作为清洗剂,在超滤结束以后对滤膜进行彻底的恢复性清洗,可以使澄清和浓缩过滤速度分别达到平均77 L/M2·h和75 L/M2·h,回收率分别达到93.1%和92.8%,使滤膜的滤过性能(NWP)基本恢复到滤前水平.
