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结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定
目的 构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达.方法 以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析；将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析；用western-blot鉴定融合蛋白的表达.结果 正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确；载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白；该蛋白能与GST抗体结合.结论 成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础.
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结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp70在原核表达载体中的克隆表达与鉴定
目的 对结核分枝杆菌的一种热休克蛋白Hsp70基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达.方法 以结核杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因Hsp70进行扩增,产物与载体质粒pET-22b(+)构建表达Hsp70的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coli DH5 α内提取质粒,酶切鉴定,再转化入表达宿主E.coli BL21(DE3)PlysS菌株内,对转化菌株以IPTG进行诱导后,破菌,离心,上清进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫印迹分析.结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,所表达的蛋白质相对分子质量为70 000,抗体检测有特异带大小为70kDa.结论 成功进行了结核杆菌分泌热休克蛋白Hsp70基因的克隆表达.
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结核分枝杆菌分泌蛋白MPT51在原核表达载体中的克隆、表达、纯化与鉴定
目的 对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT51的基因进行克隆,表达,纯化与鉴定,为核酸疫苗的研制与应用打下基础.方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对编码MPT51蛋白的抗原基因进行扩增,产物克隆到表达载体pET22b中,构建了含mpt51的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coli XLI-Blue内提取质粒,酶切及测序鉴定,再转化入E.coli BL21(DE3)PLysS菌株内,以IPTG进行诱导后,破菌,离心,包涵体经尿素变性溶解后用His·Bind亲和层析柱纯化,透析复性,纯化后蛋白进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行特异性免疫检测.结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为27 800,抗体检测有特异条带,大小为27.8kDa.结论 目的基因克隆到了表达载体内并证明表达,重组结核杆菌分泌蛋白MPT51的成功表达为核酸疫苗的研制与应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础.
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结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定
目的对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT-64基因进行克隆,鉴定与表达,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础.方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对基因MPT-64进行扩增,产物与载体质粒pGEX-4T-1构建表达MPT-64的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coli DH5α内抽提质粒,酶切检验,再转化入表达宿主E.coli BL21(DE3)PLysS菌株内,对转化菌株以IPTG进行诱导后,破菌,离心,上清进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清.结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,所表达的蛋白质相对分子质量为50 000,抗体检测有特异带大小为50kDa.结论目的基因克隆到菌株内,重组结核杆菌分泌蛋白MPT-64的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础.
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结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定
目的 构建结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白.方法 以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pGEX - 4T -1载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.进行质粒的酶切鉴定和序列分析；对重组的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析菌体蛋白,凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况,Western- blot鉴定融合蛋白.结果 正确构建了pGEX-PPE60融合表达载体,载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的50％.该融合蛋白能与GST抗体产生阳性反应.结论 成功构建了GST - PPE60融合蛋白的表达载体,并能在大肠杆菌中高效表达,为PPE60蛋白的功能研究奠定了基础.
