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人肌球蛋白调节性轻链的原核表达及纯化
目的：构建pGEX-MLC2重组质粒，在大肠杆菌中表达并纯化谷胱甘肽硫转移酶（ GST ）-MLC2融合蛋白，以用于MLC2抗体的制备。方法：从人乳腺癌MCF-7细胞中提取总RNA，通过RT-PCR获得人MLC2 cDNA全长开放读码框架（open reading frame， ORF），并将其重组于原核蛋白表达质粒pGEX-6P-1中，经限制性内切酶和DNA测序鉴定，将该重组质粒转化大肠杆菌E．coli BL21，用异丙基β-D-硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达 GST-MIC2融合蛋白后，进行 Western blotting 分析，鉴定 GST-MLC2蛋白；通过 Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白，并用SDS-PAGE电泳鉴定该融合蛋白的纯度。结果：人乳腺癌MCF-7细胞MLC2的RT-PCR产物为535 bp，符合预期；重组质粒pGEX-MLC2经BamHI和EcoRI双酶切出现特征性的525 bp片段；DNA测序证实MLC2全长ORF序列正确无误。 IPTG诱导表达的GST-MLC2融合蛋白分子质量约为46.6 kDa，纯化后其蛋白纯度约95％，经Western blotting 分析表明诱导表达的蛋白是GST-MLC2融合蛋白。结论：人MLC2蛋白原核表达质粒的构建、GST-MLC2融合蛋白的表达和纯化，为MLC2抗体的制备及MLC2功能的深入研究奠定了基础。
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Rho激酶抑制剂DL0805对血管紧张素Ⅱ刺激的大鼠离体胸主动脉环的舒张作用及机制研究
目的 探讨Rho激酶抑制剂DL0805对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)刺激的大鼠离体胸主动脉环的舒张作用与机制.方法 制备SD大鼠胸主动脉环,测定离体血管张力,观察DL0805对Ang Ⅱ收缩血管作用及量效曲线的影响;Western blot检测大鼠离体胸主动脉环肌球蛋白轻链(myosin light chain 2,MLC2)蛋白磷酸化水平.结果 DL0805对Ang Ⅱ(100 nmol·L-1)收缩的血管环具有浓度依赖性的舒张作用,其舒张血管作用部分依赖于内皮.25、50 μmol·L-1 的DL0805使Ang Ⅱ量效曲线呈非平行右移,大反应压低,pD′2 为4.65±0.04.DL0805 (25、50 μmol·L-1)抑制Ang Ⅱ(100 nmol·L-1)引起的MLC2磷酸化水平增加.结论 DL0805呈浓度依赖性地舒张Ang Ⅱ收缩的大鼠离体胸主动脉环,其机制可能与拮抗血管紧张素Ⅱ 1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R),抑制Ang Ⅱ引起的MLC2磷酸化水平增加有关.
