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一种简单高效扩增人杯状病毒ORF2区RT-PCR方法的建立及其意义
人杯状病毒(human calicivirus,HuCV)属于杯状病毒科(Caliciviridae),是单股正链RNA病毒,长约7.5 kb,其3′末端有poly(A)结构.
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江苏省南京市和无锡市两地首次检出入星状病毒HAstV-1a基因亚型
了解江苏省南京市和无锡市两地夏秋季急性胃肠炎人星状病毒(HastV)的基因亚型.收集2015～2016年6～11月江苏省南京市和无锡市两地夏秋季急性胃肠炎患者粪便标本,采用real-time RT-PCR法检测粪便中HAstV的病毒核酸,对阳性标本ORF2区进行RT-PCR扩增及测序,与GenBank公开的序列进行比对,分析基因亚型情况.江苏省南京市和无锡市两地夏秋季急性胃肠炎HAstV感染的比例为15.26％,其中50％为合并其它急性胃肠炎病毒感染,HAstV感染以秋季流行为主,包含HAstV-1a(group 2)亚型和HAstV-4c基因亚型,并且这2个亚型在两地均有分布.HastV在婴幼儿人群中感染率较高;HAstV-1a亚型为在江苏省南京市和无锡市两地首次发现及报道的亚型,可能为欧美输入性毒株,本研究为进一步了解国内HAstV分子流行特征提供依据.
关键词： 星状病毒(AstV) 人星状病毒(HAstV) 急性胃肠炎 ORF2 基因亚型 -
GⅡ-4型诺如病毒ORF2基因克隆及序列分析
目的 获得中国流行株GⅡ-4型诺如病毒(NoV)ORF2基因序列,为进一步研究诊断、疫苗提供基础依据.方法 从GⅡ-4型NoV粪便中提取病毒RNA,经逆转录后PCR并克隆到simple PMD18-T载体获得完整开放读码柜架(ORF2)阅读框序列.结果 获得了正确序列的基因Ⅱ-4,亚型(genogroup Ⅱ-4,GⅡ-4)NOV ORF2基因序列,经软件分析,3株NOV ORF2序列编码的氨基酸大小约为54KD,与VA387(GⅡ-4)氨基酸同源性为92%～93%.ORF2编码的氨基酸序列存在3个相对保守序列.结论 获得GⅡ-4型NoV ORF2基因序列,为进一步表达病毒衣壳蛋白及Nov感染的诊断试剂及防治疫苗药物研制提供基础依据.
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戊型肝炎病毒ORF2N-端和C-端多肽的抗原性分析
目的 分析戊型肝炎病毒(HEV)ORF2 N-端和C-端多肽的抗原性.方法 以纯化的4型HEV ORF2 N-端1～124 aa多肽pS4-1和4型HEV ORF2 C-端385～674 aa多肽pS4-6分别包被微孔板,采用间接酶联免疫法(EIA)检测感染HEV的猴系列血清中的抗HEV IgG抗体,分析两种多肽的抗原性,并与进口试剂的检测结果进行比较.结果 在感染HEV的猴系列血清中,针对HEV ORF2 N-端抗原的抗体产生时间早,持续时间短,其峰值与转氨酶(ALT)的峰值几乎重叠;针对HEV ORF2C-端抗原的抗体在HEV感染早期产生的滴度较低,但逐渐升高,在14周的观察期内,抗体滴度几乎无下降趋势.用两种多肽检测HEV IgG抗体的灵敏度均高于进口试剂.结论 两种多肽均具有较好的抗原性,但在HEV感染的不同时期,其反应性不同.
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CD63在戊型肝炎病毒感染中的作用机制
本研究旨在寻找戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)衣壳蛋白ORF2的相互作用蛋白,探讨其在HEV感染中的作用.采用酵母双杂交方法从人肝细胞文库中筛选与HEV ORF2相互作用的蛋白,结果显示CD63与HEV ORF2相互作用.Pull-down实验提示原核表达的ORF2与CD63结合较弱,而免疫共沉淀实验提示真核表达的ORF2能与CD63结合.流式细胞术检测结果显示,HEV易感细胞PLC/PRF/5细胞膜表面的CD63表达水平普遍低于HEV非易感细胞.过表达CD63抑制PLC/PRF/5细胞的HEV感染,而小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰CD63表达则促进HEV感染.结果提示,CD63能与HEV ORF2相互作用,可能抑制HEV感染肝细胞.
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浙江省妊娠期妇女戊型肝炎病毒抗体和核酸检测分析
目的 分析浙江省妊娠期妇女HEV感染状况及分子流行特征.方法 采用ELISA对2013年至2015年98 236名妊娠期妇女进行HEV IgM抗体筛查,并利用套式PCR法对IgM抗体阳性样本进行HEV核酸检测,进一步扩增核酸阳性样本的HEV开放阅读框(ORF)2全基因,分析其分子流行病学特征.结果 共检出352例HEV IgM抗体阳性,总阳性率为0.36％,除2例合并HBV感染外,其余均为单纯HEV IgM抗体阳性.核酸检测有3份IgM阳性血清检出HEV特异性核酸片段.进一步分析发现,3株散发性人HEV毒株均属于基因4型HEV.3株样本毒株虽然核苷酸同源性较高,氨基酸同源性更是超过97％,但在进化关系上却不在同一分支内.样本序列与国内外其他地区的毒株相比变异较大,包含1～460位核苷酸和620～870位核苷酸两个高变区,但其氨基酸位点同义替换率与非同义替换率相似,进化压力以中性选择为主.结论 浙江省内妊娠期妇女HEV感染率与已报道的普通人群感染率相似.其中分离的3株HEV毒株均为人畜共患型的HEV 4毒株,变异率较高.
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猪圆环病毒2型ORF2编码基因真核表达载体的构建及表达
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从含有PCV-2的PK-15细胞中扩增出ORF2基因,将其克隆入pSecTag2载体中,构建了pSecORF2载体.又设计一条含信号肽序列的上游引物,以pSecORF2为模板,扩增出含信号肽序列的ORF2基因,将其克隆到plREShyg载体上,构建了plRESiORF2真核表达载体.然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞,进行表达.间接免疫荧光实验(IFA)成功检测到plRESiORF2在CHO细胞中的表达.这为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.
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猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2全基因(702bp).将此片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得重组质粒pTORF2,并对此质粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ORF2与美国PCV-2分离株AF264039的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到100%,与其他PCV-2毒株同源性分别为92.3%～98 6%和92.3%～96.6%.重组质粒pTORF2经BamH I、EcoR V双酶切,回收ORF2基因,转移入真核表达载体pSec-Tag2/HygroB的相应酶切位点之间,构建成重组质粒pSecTagORF2.此重组表达载体的构建成功为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.
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039 HEV抗体检测方法的比较
对戊型肝炎病毒(HEV)进行血清学检测,早期的血清学检测局限于免疫电镜方法,特异性虽好但较为繁琐,而用HEV重组抗原进行检测,结果极佳.现在许多实验室所用的方法是用HEV不同的表达蛋白质作抗原来检测.有代表性的是NIH和GL两个实验室以表达在昆虫细胞内的分子量为55kD的ORF2外壳蛋白和ORF2或ORF3表达在E.Coli中的GST融合蛋白作抗原,用ELISA法检测抗HEVIgM和IgG.
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生物传感器对抗戊型肝炎病毒单克隆抗体部分特性的研究
目的应用生物传感器对新制备的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体(mAb)的亲和力、Ig亚类(型)及抗原结合的动力学进行研究. 方法用HEV ORF2区基因工程重组蛋白NE2, 免疫BALB/c小鼠, 经杂交瘤技术制备mAb, 采用ELISA、Western blot和生物传感器鉴定其有关特性.结果获得12株可稳定分泌抗NE2 mAb的杂交瘤细胞系.用ELISA及生物传感器等鉴定各株mAb, 分别为IgM和IgG1、IgG2a, 轻链均为κ型.其中在用ELISA法对mAb 3F5亚类鉴定过程中, 发现其与HRP-GAM IgG2a和HRP-GAM IgM均有反应, 生物传感器鉴定其为IgM.Western blot验证各株mAb的特异性, 同时各株mAb对于不同聚合形式的NE2蛋白的反应性有一定的差别.应用生物传感器测定了4株mAb的KD值, mAb 8C11为4.36×10-7, mAb 8H3为1.53×10-5, mAb 13D8为1.21×10-6, mAb 16D7为8.03×10-7.从生物传感器测得的各株mAb与NE2的结合、解离过程中发现, mAb 8H3与NE2可快速结合、快速解离, 其它3株mAb结合稳定.结论经多种方法鉴定, 所获得的12株杂交瘤细胞分泌的抗体, 为抗HEV ORF2区段的特异性抗体.
