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谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析文献资料
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多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测
目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E. Coli)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测.方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2.重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白.对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(Glutathione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化.然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析.结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经Western印迹得以验证.反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰.结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性.
