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118 软骨藻酸的毒性作用机制研究概况
软骨藻酸是由硅藻产生的兴奋性神经毒素，在过去10年对人类和海洋动物的健康产生了严重危害。国外对其毒性和作用机制做了大量调查和研究。本文从几方面讨论了其可能的毒性作用机制：(1)软骨藻酸作用于谷氨酸受体，与内源性神经递质协同发挥毒性作用；(2)引起细胞内Ca2+超载和神经元肿胀；(3)引起细胞能量代谢紊乱。
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水生态环境中神经毒性生物毒素--软骨藻酸
软骨藻酸是由水中藻类产生的具有神经兴奋作用和神经毒作用的生物毒素.本文综述了软骨藻酸的生物及化学特性、水生态环境中软骨藻酸的污染、对人体的危害,并介绍了有关中毒机制的毒理学研究内容.
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软骨藻酸对神经胶质细胞的氧化损伤及HO-1表达的影响
软骨藻酸(domoic aeid,DA)是多列型尖刺拟菱形硅藻产生的可严重危害人畜健康的兴奋性神经生物毒素[1],作用于中枢神经系统,导致中毒患者出现短时和永久记忆力丧失等神经症状[2].在我国香港海域的赤潮中发现尖刺拟菱形硅藻的存在,随着赤潮发生频率日益增多,软骨藻酸势必对人类健康和环境造成严重威胁.超氧化物歧化酶(SOD)能清除超氧阴离子自由基保护细胞免受损伤.SOD活力间接反映了机体清除氧自由基的能力,脂质过氧化物丙二醛(MDA)的含量又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度[3].
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软骨藻酸对H4细胞氨基酸释放和Ca2+浓度的影响
目的研究软骨藻酸(domoic acid)对H4细胞的兴奋性、抑制性氨基酸释放和胞内游离Ca2+([Ca2+]i)浓度的影响.方法应用高效液相色谱(HPLC)和荧光分光光度计检测0、0.064、0.64和6.4 μmol/L软骨藻酸作用于细胞2 h后的兴奋性、抑制性氨基酸释放和[Ca2+]i浓度.结果天冬氨酸和谷氨酸:中、高剂量组均高于对照组,差异有显著性(P＜0.05);甘氨酸:仅高剂量组高于对照组,差异有显著性(P＜0.05);γ-氨基丁酸:低、中和高剂量组均低于对照组,差异有显著性(P＜0.05);兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸:低、中和高剂量组均高于对照组,差异有显著性(P＜0.05).胞内[Ca2+]i:低、中和高剂量组分别为(208.65±11.01)、(342.31±15.08)和(581.36±17.24)nmol/L,高于对照组[(143.25±11.97)nmol/L],差异有显著性(P＜0.01).兴奋性氨基酸与[Ca2+]i浓度有显著的正相关性(r=0.932 0 P＜0.01).结论软骨藻酸能引起H4细胞兴奋性和抑制性氨基酸释放和胞内[Ca2+]i变化,这种变化可能是软骨藻酸兴奋性神经毒性的重要机制.
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血红素氧化酶在软骨藻酸对细胞DNA损伤中的作用
目的研究血红素氧化酶(heme oxygenase,HO)系统在软骨藻酸(domoic acid,DA)对H4细胞DNA损伤中的作用.方法应用单细胞凝胶电泳法(SCGE)分别测定0、0.064、0.64和6.4 μmol/L DA单独及与HO系统的活性阻断剂ZnPP-9(10-5mol/L)联合作用于H4细胞6、12、24和48 h后彗星拖尾细胞率及拖尾尾长.结果彗星拖尾细胞率:中剂量和高剂量组各时间点均比对照组高,差异有显著性(P＜0.05).中剂量+阻断剂组各时间点均相应高于中剂量组,差异有显著性(P＜0.05).彗星拖尾尾长:中剂量组12、24和48 h比对照组长,24、48 h比低剂量组长,差异均有显著性(P＜0.05).高剂量组各时间点均比对照组、低剂量组和中剂量组长,差异有显著性(P＜0.05).高剂量+阻断剂组和中剂量+阻断剂组24、48 h分别高于高剂量和中剂量组,差异有显著性(P＜0.05).尾长-时间作Regression分析,各剂量组r差异值均有显著性(P＜0.01).结论软骨藻酸能诱导H4细胞DNA损伤,HO系统对这种损伤有一定的保护作用.
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海水和贝类中软骨藻酸的酶联免疫吸附分析方法研究
目的 建立间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)方法测定海水样品和海洋贝类中赤潮毒素记忆缺失性贝毒主要成分软骨藻酸(DA).方法 采用碳二亚胺法,将半抗原DA分别与载体蛋白卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,得到包被抗原和免疫抗原.以DA-BSA做为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA方法分析检测海水样品和海洋贝类中的软骨藻酸.结果 低检出限为10.0ng/ml(对于贝相当于4μg/g);海水样品回收率为83.2%～124.7%,批内变异系数在4.7%～5.9%之间;贝类样品回收率为85.9%～99.9%,批内变异系数2.4%～7.1%之间.结论 建立的ELISA方法检测海洋贝类中DA可以满足国际规定的安全限值.
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软骨藻酸与人类健康关系研究进展
软骨藻酸(DA)是主要由拟菱形藻属硅藻产生的一种谷氨酸和红藻酸的类似物,能够污染鱼贝类等海洋生物,是引起人类记忆缺失性中毒的致病因子.目前世界各地均有DA检出,随着赤潮的频繁爆发和软骨藻酸中毒事件的不断发生,对软骨藻酸的研究尤其是对其兴奋性神经毒性机制的研究越来越多.本文就DA理化性质、产生菌、污染情况、人类中毒情况、毒性机制和分析方法等方面进行综述.
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软骨藻酸和谷氨酸受体
软骨藻酸是由硅藻产生的一种神经毒素,可以通过食物链蓄积,对环境和人类健康造成了严重危害.它能激活NMDA受体和KA/AMPA受体,提高神经细胞内Ca2+浓度,引起机体内一系列生理、生化反应的改变.本文介绍了软骨藻酸通过谷氨酸受体发挥神经毒作用的可能机制.
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HPLC方法检测水及水生动物中软骨藻酸
为了解水及水生动物体内软骨藻酸的污染状况,采用高效液相色谱(HPLC)方法检测了部分水及水生动物中软骨藻酸的含量.结果表明,HPLC方法是检测水及水生动物中软骨藻酸的简便有效方法.部分海洋贝壳动物体内检出软骨藻酸;海水及地面淡水中未检出软骨藻酸.为防止软骨藻酸中毒,应加强软骨藻酸污染状况的监测.
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毛细管电泳法分析贝类食品中的软骨藻酸
为监测贝类食品的食用安全,建立了毛细管电泳/紫外检测法定量测定贝类食品中软骨藻酸的分析方法.结果表明:软骨藻酸在0.2～50 μg/mL范围内具有良好的线性关系,相关系数r=0.9990;RSD＝2.56%;方法检出限为0.034 μg/g.在3个水平上对实际样品进行标准添加,回收率分别为96.80%、97.10%和96.85%.该方法简单、灵敏、高效、成本低,对记忆损失性贝类毒素的检测和监控具有重要意义.
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软骨藻酸对人神经胶质瘤细胞的氧化损害及血红素氧化酶-1表达的诱导
目的探讨软骨藻酸(domoic acid)对人神经胶质瘤(H4)细胞的氧化损害及对血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白的诱导.方法对体外培养的H4细胞分别给予0.064、0.64、6.4μmol/L软骨藻酸,24 h后测定各剂量组与对照组细胞生存率、丙二醛(MDA)含量,并采用免疫组化和流式细胞术检测HO-1蛋白表达.结果在四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)实验中H4细胞生存率随软骨藻酸剂量增大而下降,呈明显的剂量依赖关系.各剂量组MDA含量与对照组差异均有显著性(P＜0.01),6.4 μmol/L组MDA含量与0.064μmoL/L组差异也有显著性(P＜0.01).免疫组化显示,对照组细胞胞浆HO-1弱阳性染色,0.064、0.64、6.4μmol/L组分别呈低、中、高密度阳性染色.流式细胞术显示各剂量组HO-1荧光强度与对照组差异均有显著性(P＜0.01),6.4μmol/L组与0.064μmol/L组差异也有显著性(P＜0.01).结论软骨藻酸对H4细胞具有细胞毒作用和氧化损害作用,并可能通过氧化损害间接诱导HO-1蛋白表达增多.
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软骨藻酸对小鼠脑组织HO-1蛋白表达的影响
目的研究软骨藻酸(domoic acid)对小鼠脑组织丙二醛(MDA)含量及血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达的影响.方法小鼠连续5 d腹腔注射软骨藻酸染毒后,采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定小鼠脑组织中MDA含量,并用免疫组织化学方法检测小鼠脑组织中HO-1分布及表达.结果低剂量(1/90 LD50)组海马、高剂量(1/10 LD50)组大脑皮层和海马MDA含量明显升高,与对照组相比有显著性差异(P<0.05).对照组大脑皮层和海马HO-1阳性细胞平均光度(A)分别为0.095 3±0.025 2和0.094 0±0.030 4;低剂量组皮层和海马A分别为0.141 0±0.040 7和0.140 6±0.035 4,与对照组相比,有显著性差异(P<0.05);高剂量组大脑皮层和海马A分别为0.162 6±0.037 4和0.160 4±0.032 5,与对照组相比,有显著性差异(P<0.01).结论软骨藻酸对小鼠大脑皮层和海马具有氧化损害作用,并诱导皮层和海马HO-1蛋白表达增多.
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记忆丧失性贝毒素-软骨藻酸的HPLC方法检测
软骨藻酸(Domoic Acid,DA),作为一种罕见的天然神经毒性氨基酸,由它引发的食物中毒可引起呕吐、腹泻神志不清、记忆丧失、眩晕、昏迷甚至死亡,根据这种新型贝毒与其它贝毒特征的差别,被命名为记忆丧失性贝毒(AmensicShell-fishPoisoning,ASP)[1,2].
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软骨藻酸诱导PC12细胞凋亡及对活性氧的影响
[目的]研究软骨藻酸诱导PC12细胞凋亡及对活性氧的影响. [方法]流武细胞仪法测定0、0.01、0.1、l μmol/L软骨藻酸作用PCI2细胞24h后,对细胞凋亡、细胞周期和活性氧生成的影响. [结果]软骨藻酸可诱导PC12细胞凋亡的发生,与对照组(凋亡率为0.250±0.053)相比,所有染毒浓度组PCI2细胞凋亡率均上升且差异有统计学意义;并将PC12细胞阻滞于细胞周期中的G2/M期,0.1、1 μmol/L组中处于G2/M期的PC12细胞数量与对照组相比,差异具有统计学意义;所有浓度组均可使PC12细胞的活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)平均荧光强度增加(0.01 μmnol/L组为187.140±3.629,0.1 μmol/L组为206.023±5.277,1 μmol/L组为348.915±3.343),与对照组(163.660±4.059)相比,差异均具有统计学意义.[结论] 软骨藻酸能诱导PC12细胞凋亡的发生,将PC12细胞阻滞于细胞周期中的G2/M期,并使得细胞内的ROS产生增加.
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鲜淡菜中软骨藻酸的液相色谱紫外法研究
[目的]根据美国FDA对软骨藻酸(domoic acid)的控制指标,建立一种简便的水产品中软骨藻酸液相色谱紫外测定方法.[方法]采用含甲醇的水溶液,选择性地提取鲜淡菜中软骨藻酸,经离心、过滤等手段进行样品处理,在优化的条件下进行液相色谱检测.[结果]本研究方法的实际测定生物样品--鲜淡菜中软骨藻酸范围为0.12～50mg/kg,低检测限达到0.007 mg/kg,并且在现有分离条件下无明显干扰物存在;同时经与原分析方法比对,具有很好的一致性.[结论]本方法建立了生物样品鲜淡菜中软骨藻酸的液相色谱紫外测定方法,具有简便、快速的特点,能适合在一般分析实验室开展此项检测工作.
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软骨藻酸对H4细胞血红素氧化酶-1的诱导
[目的]研究软骨藻酸对H4细胞血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的诱导.[方法]流式细胞仪检测0、0.064、0.64、6.4μmol/L软骨藻酸作用细胞24 h后HO-1蛋白表达、HO-1 mRNA转录和HO-1酶活性.[结果]HO-1蛋白表达:0.064、0.64、6.4 μmol/L浓度组的荧光强度分别为(68.07±7.07)、(81.34±8.64)和(81.95±8.30),与对照组(60.60±5.36)比较,差异均有显著性(P＜0.01).HO-1 mRNA转录:0.064μmol/L组相对表达量为(0.439±0.007),与对照组(0.411±0.008)比较差异无显著性(P＞0.05);0.64μmol/L和6.4μmol/L组分别为(0.506±0.013)和(0.631±0.036),与对照组比较差异有显著性(P＜0.01).HO-1酶活性:0.064mol/L组为(389.32±34.75)pmol/(mg·h),与对照组(326.75±27.05)pmol/(mg·h)相比,差异无显著性(P＞0.05);0.64和6.4μmol/L组分别为(461.75±27.84)和(687.50±35.93)pmol/(mg·h),与对照组相比,差异有显著性(P＜0.01).前述3指标结果均有随剂量浓度增加而逐渐升高的趋势.[结论]软骨藻酸能诱导H4细胞HO-1蛋白表达、HO-1mRNA转录和HO-1酶活性升高.
关键词： 软骨藻酸 血红素氧化酶-1 H4人神经胶质瘤细胞 -
一氧化氮合酶抑制剂干预前后软骨藻酸对PC12细胞存活率及NO的影响
[目的]研究一氧化氮合酶(NOS)抑制剂干预前后软骨藻酸(DA)对PC12细胞存活率及其产生一氧化氮(NO)的影响. [方法] MTT法检测PC12细胞的存活率;Greiss法测定PC12细胞培养基上清中的NO含量.L-NAME干预前,MTT实验分为对照组及0.0001、0.001、0.01、0.1、1.0μmol/LDA处理组;NO含量测定时分为对照组及0.01、0.1、1.0μmol/LDA处理组.L-NAME干预时,MTT实验及NO含量测定均分为对照组,单纯1.0μmol/L DA处理组,250、1000、2500μmol/LL-NAME+1μmol/LDA处理组.[结果]随着DA染毒剂量的升高,PC12细胞的存活率逐渐下降;0.01、0.1、1.0μmol/L DA作用PC12细胞24h后,细胞培养基上清NO水平均升高,差异有统计学意义,P<0.05;L-NAME浓度为1000、2500μmol/L干预时,PC12细胞存活率增加,NO生成减少. [结论]DA对PC12细胞具有毒性作用.可以降低细胞的存活率,诱导细胞NO生成增加;NOS抑制剂具有一定保护作用,可明显抑制DA诱导PC12细胞NO生成增加.
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NF-κB抑制剂干预前后软骨藻酸对PC12细胞存活率的影响
目的 研究核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂(PDTC)干预前后软骨藻酸(DA)对PC12细胞存活率的影响.方法 免疫荧光细胞化学法测定软骨藻酸对PC12细胞NF-κB蛋白的影响;MTT法检测PC12细胞的存活率.结果 随着DA染毒剂量的升高,PC12细胞NF-κB表达均升高(P<0.05);PDTC干预后,PC12细胞存活率均升高.结论 DA可诱导PC12细胞NF-κB表达增加;PDTC具有一定的保护作用,可明显提高PC12细胞的存活率.
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舟山海域贝类海产品中软骨藻酸含量调查
目的:对舟山海域贝类等海产品中软骨藻酸含量进行初步调查.方法:采集舟山海域出产的贝类等海产品,使用高效液相色谱法对其中的软骨藻酸含量进行定量分析.结果:舟山海域贝类等海产品中软骨藻酸的总检出率为64％,含量范围为ND - 1.68 mg/kg,含量中值0.21 mg/kg,贻贝等海产品中毒素含量相对较高.结论:舟山海域贝类等海产品中软骨藻酸总体含量远低于卫生标准限值,目前暂不存在食用风险.
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HPLC/DAD/ESI/MSD测定和确证贝类样品中软骨藻酸
1前言软骨藻酸(Domoic acid,DA)是一种天然神经性氨基酸,从污染贝类中分离、提取获得.人们食用毒化的贝类,可引起记忆丧失、眩晕、昏迷甚至死亡等症状,根据这种毒素的中毒特征,被命名为记忆丧失性贝毒(Amnesic Shellfish Poisoning,ASP).不少国家制定了20μg/g限量标准[1].目前测定贝类中软骨藻酸的方法主要有高效液相色谱法[2]、毛细管电泳法[3]、小白鼠生物学试验法[4]等,其中高效液相色谱法是检测贝类中DA公认的有效方法.本文对贝类中DA的提取、净化、色谱条件和质谱条件进行了探索,建立了贝类中DA的HPLC/DAD/ESI/MSD测定和确证方法.该方法简单易行,结果令人满意.
