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密码子优化IL-18基因的合成与蛋白质高表达
目的：为研究IL-18密码子优化合成与蛋白质高表达，更好的发挥IL-18在基础研究与临床中的应用，本研究采用野生型IL-18在大肠杆菌中表达高频率的密码子，自行设计8个PCR片段，用PCR；方法：得到IL-18的cDNA，利用EcoR I双酶切将其插入pGEX-4T-1载体中，转化大肠杆菌JM109。筛选出阳性菌落，提取质粒，转化大肠杆菌BL-21 DE3中进行表达，纯化。结果：显示：经纯化所获得的优化IL-18的氨基酸序列、生物学活性与野生型IL-18完全一致，蛋白质产量较野生型IL-18高约5倍。结论：本研究可以实现较高水平的蛋白质，也给纯化带来了方便，为大规模生产提供了较理想的表达株，同时为治疗性疫苗研究奠定了基础。
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替换稀有密码子提高HBsAg在CHO细胞中的表达量
目的通过替换S基因稀有密码子,提高HBsAg在CHO细胞中的表达量.方法利用重叠PCR技术,将S基因上3个稀有密码子替换成哺乳动物细胞偏爱的密码子,得到Sm基因.把S和Sm基因分别克隆到pCI载体上,并转染CHO(dhfr)细胞,利用ELISA方法检测HBsAg的表达量.结果获得预期的Sm基因.在CHO细胞中,Sm基因表达量明显高于S基因.结论替换S基因稀有密码子可以提高HBsAg的表达量.
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融合蛋白AnxB1ScuPA表达质粒的构建及诱导条件优化
目的:在大肠杆菌中高效表达融合基因AnxB1ScuPA.方法:利用PCR技术扩增AnxB1ScuPA的融合基因,克隆至原核表达载体pET-28a;转化几种不同的宿主菌(感受态细菌BL21、Rosetta、BL21-RIL),利用IPTG(终浓度为0.5 mmol/L)诱导蛋白表达,并对表达条件进行优化,根据凝胶扫描定量结果确定合适的宿主菌和诱导表达条件.结果:AnxB1ScuPA在具有稀有密码子tRNA的宿主菌BL21-RIL表达量较其他宿主菌为高.在菌液生长至D600＝0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.4 mmol/L,诱导0.5 h后加入利福平至终浓度150 μg/ml,可使蛋白AnxB1ScuPA的表达量提高至菌体总蛋白的36%.结论:通过选择具有稀有密码子tRNA的宿主菌BL21-RIL和优化诱导条件,使AnxB1ScuPA在大肠杆菌中得到高效表达.
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改造稀有密码子对rhFGF8a原核表达的影响
目的:构建重组人成纤维细胞生长因子8a(rhFGF8a)高效表达载体,提高该蛋白的表达量.方法:采用PCR技术设计引物替换rhFGF8a基因N端的稀有密码子以及稀有终止子,构建原核表达载体pET22b-mrhFGF8a,转化大肠杆菌,用异丙基β硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,Sephacryl S-200纯化表达蛋白,MIT法检测其生物学活性.结果:表达产物经SDS-PAGE、Western blot鉴定,目的蛋白量占全菌蛋白的31%,Sephacryl S-200纯化后蛋白纯度可达97.28%,且具促进NIH3T3细胞增殖活性.结论:通过改造稀有密码子的方法有效地提高了真核基因在原核表达体系中的表达量.
