首页 > 文献资料
-
定点诱变法构建β地中海贫血IVS-2-654(C＞T)突变基因质粒
目的 构建含β地中海贫血(简称β地贫)IVS-2-654 (C＞T)突变基因的质粒.方法 以含β珠蛋白野生型基因的质粒DNA为模板,采用重叠延伸PCR (OE-PCR)定点诱变后行TA克隆的方法构建含IVS-2-654 (C＞T)突变基因的质粒.结果 双向测序结果表明:重组质粒的确含β地贫IVS-2-654 (C＞T)突变基因,β珠蛋白IVS-2-654处的碱基已由C突变成T,其余序列与野生型完全相同,成功实现了定点诱变.结论 成功地构建了含β地贫IVS-2-654 (C＞T)突变基因的质粒,进一步为该病基因诊断与筛查技术的研究奠定了实验基础；OE-PCR定点诱变法简便、经济,值得推广应用.
-
α-Synuclein磷酸化修饰提高MN9D细胞内TH的活性
目的 观察突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)第129位丝氨酸(Ser129)磷酸化修饰对酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)活性的影响.方法 应用重叠延伸PCR定点突变法将129位丝氨酸编码碱基TCT突变为天冬氨酸(Asp,D)编码碱基GAT,获得编码模拟磷酸化α-Syn(S129D α-SYN)的DNA序列,插入逆转录病毒真核表达载体(pLNCX2).包装逆转录病毒颗粒并感染多巴胺能神经细胞MN9D.通过实时定量RT-PCR鉴定α-SYN基因表达,Western blot检测TH磷酸化水平.结果 pLNCX2-α-SYN(wild type/S129D)质粒测序结果正确,并在MN9D细胞中均过表达.野生型α-SYN过表达组同正常对照组相比TH磷酸化水平降低(P＜0.01),而S129D α-SYN组TH的磷酸化水平同正常对照组相比明显升高(P＜0.05).结论 在MN9D细胞中,野生型α-SYN抑制TH的活性,而α-SYN Ser129磷酸化后TH活性明显升高.
-
双功能域小分子补体受体1型衍生物的构建、表达、纯化及生物功能鉴定
目的 克隆表达出能够抑制补体活化的双功能域小分子补体受体1型(complementreceptor type 1,CR1)衍生物.方法 从外周血提取总RNA,进行RT-PCR扩增出功能性片段Ⅰ(CR1-SCR1-3);以本室构建的pET-32a-CR1-SCR15-18为模板扩增功能性片段Ⅱ(CR1-SCR15-17);利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法扩增出包含双功能域的融合基因.将融合基因重组于pET-32a(+)载体,转化大肠杆菌Rosetta,经酶切及DNA序列测定鉴定后,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白质进行分析鉴定.蛋白质经Ni柱亲和层析及透析复性后,采用50%补体溶血抑制试验(CH50)进行功能鉴定.结果 酶切及DNA序列测定证实成功构建出了pET-32a-CR1-SCR(1-3+15-17)重组表达载体,IPTG诱导表达后在相对分子质量(Mr)为63×103处有一明显的条带,经Westernblot鉴定为目的 蛋白,Ni柱亲和层析获得纯度约为92%的目的 蛋白,功能试验证实,在0～200 μg/ml的融合蛋白剂量范围内,随着浓度的增加,补体抑制活性增强.结论 成功构建并在大肠杆菌内表达了具有较高生物活性的重组双功能域小分子CR1衍生物,为体内保护实验研究提供实验数据.
-
抗体库优化策略对特异性抗肝癌单链抗体的人源化
目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,把难以判断回复突变残基的人、鼠源副本同时编入人源化抗体序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化抗体全基因,利用噬茵体展示技术构建人源化组合抗体库;通过肝癌细胞筛选阳性克隆,ELISA方法测定各个克隆抗原结合活性;用硫氰酸盐洗脱法测定并比较亲本抗体和人源化scFv的相对亲和力.结果:成功构建人源化组合抗体库,实际库容4.77×10 5,包含由2 5不同重链和2 2不同轻链组成的128种人源化DM;经过筛淘及ELISA鉴定,获得HDM1、HDM2和HDM3 3个阳性克隆,相对亲和力指数分别为HDM1 1.6 mol/L、HDM2 1.2 mol/L和HDM3 2.2 mol/L.结论:抗体库优化法是一个高效、简便的人源化方法;获得的3株阳性克隆HDM1、HDM2、HDM3与亲本抗体DM同样具有良好的抗原结合特异性和较高的亲和力.
-
嵌合分子CblN/Grb2构建及其原核表达
目的构建CblN/Grb2嵌合分子,表达和纯化GST-CblN/Grb2融合蛋白,并考察嵌合分子CblN/Grb2在体外是否具有泛素连接酶活性.方法提取SKBR-3细胞的总RNA并反转录为cDNA,作为模板用PCR扩增Grb2基因的SH2片段;含有人全长Cbl cDNA的质粒pEFHACbl 作为模板扩增Cbl基因N-端(CblN); 用重叠延伸PCR方法,在CblN 内部SH2两端引入BamH Ⅰ和EcoR V酶切位点并克隆入pcDNA3.1(+).再以Grb2基因的SH2置换CblN 的SH2即成为pcDNA3.1(+)-CblN/Grb2;以其为模板,通过PCR方法扩增CblN/Grb2并将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达GST-CblN/Grb2融合蛋白并用Glutathione Sepharose 4B进行纯化;通过体外泛素化实验检测GST-CblN/Grb2是否具有泛素连接酶活性.结果成功构建了pGEX-4T-2-CblN/Grb2融合表达载体;在大肠杆菌DH5α中表达了GST-CblN/Grb2融合蛋白并获得了纯化蛋白; 体外泛素化实验表明GST-CblN/Grb2具有泛素连接酶活性.结论 GST-CblN/Grb2 的表达、纯化及其体外活性的鉴定为进一步研究该嵌合泛素连接酶对HER2阳性肿瘤细胞生长的影响奠定了基础.
-
重组人血管能抑制素分泌型表达载体的构建及其生物学效应研究
目的构建表达分泌型人血管能抑制素(canstatin)蛋白的真核表达载体,观察其生物学效应.方法以SOE PCR法将canstatin及癌胚抗原(CEA)引导肽cDNA体外连接,并定向克隆到真核蛋白表达载体pCMV-Script上,脂质体介导转染HUVEC及A549细胞,荧光定量PCR法检测转染细胞canstatin基因表达量,并采用多种方法检测该重组载体的生物学活性.结果成功构建canstatin分泌型载体,在其转染的肿瘤细胞和人脐静脉内皮细胞中均检测到不同拷贝数的表达.转染后HUVEC生长增殖缓慢,出现G0～G1期阻滞并伴有大量凋亡,与空载体转染组相比差异有统计学意义(P<0.05);而A549细胞转染后与空载体转染组在以上几个方面差异均无统计学意义(P>0.05).重组载体转染A549细胞上清液干预的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成明显减少,且颜色苍白、轮廓模糊,空载体转染组和未干预组血管生长旺盛、脉络清晰.结论 SOE法构建的含有CEA引导肽的canstatin分泌型表达载体能在转染的内皮细胞及肺癌细胞中稳定表达,可有效抑制内皮细胞生长增殖并诱导凋亡.重组载体转染的细胞可分泌有生物学活性的canstatin.
-
重叠PCR克隆Exendin-4的基因及序列分析
目的 克隆Exendin-4 39肽氨基酸序列基因编码区cDNA.方法 根据Exendin-4氨基酸序列编码cDNA,设计正、负向引物/模板链,利用重叠延伸PCR法扩增出Exendin-4编码区基因DNA片段；将获得的基因片段插入pGEM-T-Easy质粒中；转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,利用限制性内切酶及核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒.结果 经质粒DNA酶切分析及序列测定,获得了Exendin-4 DNA片段序列.结论 本研究成功克隆了Exendin--4 cDNA,为下一步构建Exendin-4真核表达载体打下基础,也为Exendin-4基因治疗糖尿病提供了前提条件.
-
一步PCR法在单碱基定点诱变中的应用
定点诱变技术广泛应用于基因工程和蛋白质工程,常用的方法有化学诱变、寡核苷酸介导的诱变,盒式诱变和基于PCR的诱变,其中基于PCR的诱变包括重叠延伸PCR(over-lap extension PCR,OEPCR),大引物PCR(mega primer PCR),环状质粒PCR.本方法属于环状质粒PCR,与常用的OE-PCR相比,本方法在质粒上进行诱变更为简便快捷,只需设计一对引物,进行一次PCR.
-
雄激素受体基因第一外显子区CAG缺失的构建及其在HEK293细胞中的表达
目的:构建雄激素受体基因第一外显子区CAG重复序列缺失的突变重组体,观察CAG重复序列的有/无对雄激素受体转录及表达的调控作用.方法:实验于2006-05/2007-05在解放军总医院老年医学研究所完成.按照重叠延伸反应的原理扩增CAG重复序列两端的基因片段,再将两片段混合,在加入一个引物的情况下进行8个PCR循环以有效完成重叠延伸,然后再加入另一引物进行22个循环,完成目的片段指数扩增,将目的片段克隆至真核表达载体PAR-IRES2-EGFP,转染HEK293细胞,采用Western blot法检测HEK293细胞雄激素受体蛋白.结果:构建的CAG重复序列缺失的突变重组体经酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,转染真核细胞可检测到雄激素受体基因的表达.结论:重叠延伸PCR是进行体外基因拼接、体外缺失突变的简单、快速的基因重组技术;雄激素受体基因第一外显子区CAG重复序列缺失的突变重组体的成功构建可为今后的相关研究提供实验基础.
-
抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建与表达
目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达.方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP-N1,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察荧光蛋白表达,流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375结合活性.结果:测序表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,表达载体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察转染细胞,及通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达,并能够与天然高表达TfR的细胞特异性结合.结论:抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白真核表达载体构建成功,其表达产物具有与TfR阳性细胞结合的活性.
-
人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定
目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定.方法:从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,用直接PCR及半巢式PCR扩增人抗体重链(VH)及轻链(Vκ和Vλ)可变区基因.采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL(Vκ和Vλ)基因连接成人单链抗体(scFv)基因,并将scFv文库基因克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E中,电转化E.coli TG1,构建单链抗体文库.结果:采用直接PCR和半巢式PCR扩增得到42条VH基因片段,16条Vκ基因片段,18条Vλ基因片段.混合的VH和VL等摩尔比连接后,产生的单链抗体文库基因大小为750 bp左右;转化后构建了文库容量为1.35×108的单链抗体文库.BstN Ⅰ酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的scFv指纹图谱均不相同.结论:构建的抗体文库多样性好,可用于多种人源性单链抗体的筛选.
-
小鼠β-防御素2与甲型流感病毒HA1融合基因真核载体的构建与表达
目的:构建小鼠β-防御素2(mBD2)与甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)血凝素(HA1)基因融合表达的真核载体,并检测其在HEK293细胞中的表达.方法:用PCR技术分别从质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增mBD2与HA1基因片段,再用重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将HA1与mBD2通过一段多肽接头Gly4 Ser融合为mBD2-HA1.将mBD2-HA1融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切、PCR和测序鉴定正确后,用脂质体转入HEK293细胞,通过免疫荧光检测其瞬时表达.结果:融合基因mBD2-HA1的真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1构建成功,并在HEK293细胞中成功表达融和蛋白.结论:融合基因mBD2-HA1真核表达载体的成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础.
-
获得重构基因的简捷方法--重叠延伸PCR
目的:构建IFN-β信号肽序列与白细胞介素18(IL-18)成熟肽的重组嵌合分子.方法:从BALB/c鼠基因组DNA扩增IFN-β信号肽序列;由小鼠Pro-IL-18真核表达质粒获得IL-18成熟肽序列;以非对称PCR技术得到IFN-β信号肽编码区的反义链和IL-18成熟肽正链;采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)产生具有IFN-β信号肽与IL-18成熟肽的嵌合编码序列;定向连方式构建嵌合IL-18的表达质粒并测序.结果:连续胶PAGE表明非对称PCR可分别扩增出两个靶序列的特异性单链,大小符合预期.IFN-β信号肽对称PCR产物与IL-18非对称PCR产物混合作为模板,进行重叠延伸;电泳分析可见清晰的嵌合片段;测序显示重组质粒的表达框由两个设计的靶序列构成,且无移码.结论:重叠延伸PCR是一种获得重构基因的简捷方法.
-
人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体的原核表达及纯化
目的:克隆人源抗菌肽( Antimicrobial peptide,AMP)LL-37及其改良体串联体基因,原核表达并纯化重组蛋白.方法:利用生物信息学手段,对人源抗菌肽Ll-37基因序列进行改良设计,合成人源抗菌肽LL-37及其改良体基因片段,经重叠延伸PCR获得人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-dLL-37,转化大肠杆菌BL21( DE3 )pLysS,IPTG诱导表达,Tricine SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,镍金属螯合亲和层析纯化重组蛋白.结果:改良后的人源抗菌肽LL-37的等电点、稳定性及其在大肠杆菌中的半衰期均显著提高；重组表达质粒pET-28a-dLL-37经测序鉴定构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为11000,主要以包涵体形式存在；纯化的重组蛋白纯度可达95％,浓度为0.473mg/ml.结论:已成功在大肠杆菌中表达并纯化了人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体,为其后续生物学活性的研究奠定了基础.
-
人内皮抑素基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达
目的 对人内皮抑素(hES)基因进行定点突变,提高其在大肠杆菌中的可溶性表达量.方法 根据Internet网站提供的关于hES的结构信息及其结构与功能方面的研究文献,设计突变位点;利用生物信息学的相关网站,对hES突变体进行结构预测,验证突变位点设计的合理性;采用重叠延伸PCR方法进行hES基因的定点突变,并将突变基因和未突变基因分别亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,在大肠杆菌中进行融合表达,比较突变前后目的 蛋白的可溶性表达量.结果 三级结构预测结果表明突变位点设计合理,序列分析结果表明实现了hES基因的定点突变.突变基因的表达产物中,可溶性部分约占总表达量的40%,而未突变基因的表达产物几乎全部为包涵体.结论 已成功对hES基因进行了定点突变,突变后的hES可溶性表达量得到了提高.
-
一种肺炎链球菌重组蛋白PsaA-PspA23原核表达载体的构建及表达
目的 优化肺炎疫苗重组蛋白基因PsaA-PspA23的同源区序列,阻止该基因的组氨酸标签(His-tag)融合表达,对突变后的目的基因进行表达及鉴定.方法 以肺炎疫苗重组蛋白基因PsaA-PspA23为模板,设计2对具有重叠区的特异性引物,并分别对该重组基因进行扩增,得到PsaA-PspA2和PspA3的CDR区(亚类决定区)基因片段.利用重叠延伸PCR(Overlap PCR)技术,将PsaA-PspA2基因片段和PspA3的CDR区基因片段连接,得到同源区优化后的基因片段.利用PCR技术扩增同源区优化后的基因片段,使该基因3'末端引入终止密码子,阻止PsaA-PspA23基因表达载体上His-tag的融合表达.将得到的片段同源区优化且无His-tag融合表达的目的基因连接至pET20b载体后,转入大肠埃希菌(E.coli中进行表达,表达产物进行Western blot分析.结果 重组表达质粒pET20b-PsaA-PspA23经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;转化E coli中,37℃,IPTG终浓度1 mmol/L诱导5h,获得可溶性表达的重组蛋白,且无His-tag.结论 PsaA-PspA23蛋白基因同源区优化及His-tag成功去除,并在原核表达系统E.coli中可溶性表达,可为PsaA-PspA23蛋白疫苗的进一步研究奠定基础.
关键词： 组氨酸标签 肺炎链球菌表面蛋白A 同源区序列 重叠延伸PCR -
小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达
目的 克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白.方法 采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 重叠PCR法扩增出692 bp的OAZI功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达.纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合.结论 已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因.原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白.
-
小鼠IL-27真核表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达
目的:构建小鼠白介素27(Interleukin 27,IL-27)单链融合基因的真核表达载体并检验其在RAW264.7细胞中的表达情况.方法:提取小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出小鼠EBB和p28 cDNA.采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3和p28基因片段,构建小鼠IL-27单链融合基因(mouse single chain IL-27,mscIL-27),并将其克隆至pcDNA3.1(+)载体.通过酶切和测序鉴定阳性重组载体,将重组质粒pcDNA3.1-IL-27通过脂质体转染法转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:测序分析表明,小鼠IL-27单链融合基因中EBB、linker和p28的连接顺序、方向及碱基序列与预期相符.在转染后的RAW264.7细胞中检测到了小鼠IL-27 mRNA的表达.结论:成功构建了小鼠IL-27单链融合基因及其真核表达载体,并在RAW264.7细胞中实现表达,为进一步探讨IL-27的生物学功能奠定了基础.
-
定点突变三种方法的比较研究
目的:通过使用优化后的定点突变三种方法分别时一个新基因重组栽体进行定点突变研究,比较这几种定点突变方法的优缺点.方法:重叠延伸PCR法使用Stratagene在线定点突变引物设计程序从而使引物设计简化而可靠;MutaBEST定点突变试剂盒采用胶纯化试剂盒代替说明书推荐的酚一氯仿抽提质粒的方法以提高回收率;使用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶和超级感受态试剂盒代替Quikchange定点突变试剂盒的相应组分可使产物不受影响同时降低试验费用.结果:三种方法都能够获得单碱基突变重组栽体.结论:QuikChange突变策略通过改进是一种高效、简洁、经济和可靠的定点突变方法.
关键词： 重叠延伸PCR MutaBEST QuikChange 定点突变 -
L-门冬酰胺酶突变体的构建及其活性测定
目的:将L-门冬酰胺酶抗原表位区域的两个肽段作为突变对象,构建9个突变体,并对其酶活力和蛋白表达量与原酶进行比较研究.方法:根据丙氨酸扫描原理,应用重叠延伸PCR技术构建突变体,并对突变菌株进行基因测序和酶活力测定.结果:构建成功的突变菌株均具有酶活力,且蛋白表达水平不受影响.结论:首次采用基因修饰,改变L-门冬酰胺酶抗原表位区域的肽段,而不影响其酶活力,为后续研究和探讨L-门冬酰胺酶抗原表位结构与功能的关系提供了基础.
