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抗体库优化策略对特异性抗肝癌单链抗体的人源化
目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,把难以判断回复突变残基的人、鼠源副本同时编入人源化抗体序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化抗体全基因,利用噬茵体展示技术构建人源化组合抗体库;通过肝癌细胞筛选阳性克隆,ELISA方法测定各个克隆抗原结合活性;用硫氰酸盐洗脱法测定并比较亲本抗体和人源化scFv的相对亲和力.结果:成功构建人源化组合抗体库,实际库容4.77×10 5,包含由2 5不同重链和2 2不同轻链组成的128种人源化DM;经过筛淘及ELISA鉴定,获得HDM1、HDM2和HDM3 3个阳性克隆,相对亲和力指数分别为HDM1 1.6 mol/L、HDM2 1.2 mol/L和HDM3 2.2 mol/L.结论:抗体库优化法是一个高效、简便的人源化方法;获得的3株阳性克隆HDM1、HDM2、HDM3与亲本抗体DM同样具有良好的抗原结合特异性和较高的亲和力.
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用硫氰酸盐洗脱法筛选高亲和力噬菌体抗体
目的:建立一种从抗体库中筛选高亲和力噬菌体抗体的方法.方法:选择已知亲和力高低不同的噬菌体抗体以不同的比例组成模拟抗体库,在常规筛选程序的基础上,用不同浓度的硫氰酸盐进行洗脱,选择性去除低亲和力抗体,保留高亲和力体,对后获得的噬菌体抗体制备质粒DNA进行内切酶谱分析,判断其中高亲和力抗体的比例.结果:实验证明工作浓度硫氰酸盐的孵育不影响噬菌体颗粒的感染活性 ;抗体库筛选过程中用硫氰酸盐进行洗脱,发现随着硫氰酸盐浓度的增加,洗脱回收的噬菌体抗体中高亲和力克隆的比例逐渐升高.结论:硫氰酸盐洗脱法用于噬菌体抗体的筛选有助于成功获得期望的高亲和力抗体.
