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大容量抗体库高通量筛选方法的研究进展
随着蛋白质组学研究的发展,抗体在疾病的诊断、治疗和基础研究上的作用越来越大,迫切要求发展高通量的抗体筛选方法.本文研究整理了近几年在噬菌体抗体高通量筛选方法上的研究进展,对磁珠法、基于自动化工作站的普通ELISA法、膜法、微阵列芯片法和液相悬浮芯片法等高通量筛选方法进行了综述.
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通过基因突变提高噬菌体蛋白Ⅷ介导的抗体Fab段的展示
目的构建基因Ⅷ变种文库,筛选表面展示效率高的突变体,改进抗体分子在噬菌体表面的呈现效果.方法通过重叠PCR,在基因Ⅷ引入随机突变,克隆到抗乙肝表面抗原(HBsAg)的噬菌体抗体表达载体中,使抗HBsAg的Fab段通过蛋白Ⅷ展示于噬菌体表面,构建蛋白变种Ⅷ文库,筛选能使HBsAg表面呈现效果得到提高的蛋白Ⅷ突变体.结果构建了一个库容为6×108的基因Ⅷ变种文库,使用游离抗原竞争、硫氰酸盐洗涤等方法进行淘筛,获得多个展示活性高于野生型蛋白Ⅷ的突变体,其中2个好的变种可使表面呈现效果提高50～70倍.结论通过对基因Ⅷ的改造可提高其对抗体Fab段的展示性能,获得2株可使展示活性提高50～70倍的基因Ⅷ突变体.
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用噬菌体蛋白Ⅸ展示抗HBsAg分子Fab段
目的用丝状噬菌体外壳蛋白Ⅸ(pⅨ)展示抗体Fab段,并与外壳蛋白Ⅲ(pⅢ)展示效果进行比较. 方法采用PCR方法钓取噬菌体蛋白Ⅸ基因,构建pⅨ展示抗乙肝表面抗原Fab的表达载体,制备噬菌体抗体,鉴定其抗原结合活性和Fab呈现水平,观察了噬菌体洗脱回收效率,并与pⅢ展示进行比较. 结果噬菌体pⅨ可以展示有功能活性的抗体Fab段,但对Fab的展示率低于pⅢ,展示率的高低可能与pⅨ展示的外源蛋白分子量大小有关."结合-洗脱-回收"实验显示,酸洗脱法回收的Fab-pⅢ噬菌体的感染活性大为下降,而对Fab-pⅨ噬菌体无影响. 结论 pⅨ成功展示Fab段,讨论了pⅨ展示体系可能具有的优越性.
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抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选、鉴定和免疫活性检测
近年来,随着噬菌体抗体表面展示技术的不断发展,人们正广泛应用该技术研制各种人源噬菌体单链抗体.单链抗体仅为完整抗体的六分之一[1,2],因其具有分子小、容易进入病灶周围的微循环及在肾脏内清除异物快等优点,在疾病的治疗方面引起广泛重视.本研究利用该技术,成功地筛选到了抗细粒棘球蚴重组B抗原的人源单链可变区抗体,并对其特异性进行了鉴定.
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将抗体库所获抗-HBs Fab转换为全长人IgG
目的 将大肠杆菌表达的抗-乙肝表面抗原(HBs)人Fab转换为真核表达的全长人IgG1.方法 用重叠PCR法将人工合成的人Vκ前导序列拼接到抗-HBs的VH和Vκ上,构建人IgG1真核表达载体,转染真核细胞,通过ELISA、RT-PCR、免疫印迹检测抗-HBs人IgG的表达.结果 用轻链和重链同时表达的单一载体在CHO细胞中获得了抗-HBs人IgG的表达.结论 通过噬菌体抗体库所获Fab段可经拼接人Vκ前导序列在真核获得功能性表达.
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前列腺癌噬菌体抗体库的构建及抗特异性膜抗原抗体的筛选
目的 建立国人前列腺癌噬菌体Fab抗体片段库,筛选、鉴定抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人源Fab抗体可变区的编码基因,为前列腺癌的诊断与基因治疗研究开辟新途径.方法 20例前列腺癌患者外周血分离淋巴细胞,提取其总RNA,经RT-PCR及半套式扩增得到免疫球蛋白全部轻链和重链Fd段基因,克隆进载体pComb3,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建前列腺癌噬菌体Fab抗体片段库.采用噬菌体表面展示技术,以PSMA原核表达重组子pET30a(+)-PSMA诱导表达并纯化后的PSMA为固相抗原,从噬菌体Fab抗体库中经过"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的PSMA人源Fab可变区抗体基因片段的阳性克隆,并进行免疫检测及序列测定.结果 成功构建前列腺癌噬菌体抗体Fab片段库,其轻链及重链Fd段与载体DNA的重组率分别为87%、79%,库容为2.32×107,滴度为8.7×1013 pfu/ml.筛选得到Fab抗体克隆的Fd段基因核苷酸序列为696 bp,编码由232个氨基酸残基组成的多肽,与人免疫球蛋白γ链恒定区的同源性为98%;轻链κ基因核苷酸序列为630 bp,编码由210个氨基酸残基组成的多肽,与κ链恒定区同源性为93%.结论 成功构建了前列腺癌噬菌体抗体库,并获得了PSMA人Fab抗体可变区编码基因克隆,该克隆抗体基因具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有与PSMA反应的免疫学活性和特异性.
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9E10单抗Fab基因的克隆及噬菌体抗体的表达
选择感染性噬菌体(SIP)技术特别是体内SIP技术在理论上适合于"库-库筛选",目前已成了一个研究热点.然而要验证"库-库筛选"的可行性,必须有一个比较明确的相互作用的蛋白对.9E10单抗是针对C-myc蛋白一个十肽表位的抗体,它们间的相互作用有非常好的特异性,是研究蛋白间相互作用的优选模式体系,因此本文进行了9E10单抗基因的克隆及噬菌体抗体的表达.
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人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析
目的 筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析.方法 利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列.结果 从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A90值高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A190为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VH Ⅰ亚群,轻链可变区(VL)属于Vk Ⅰ和VkⅢ亚群.结论 从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsng噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础.
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抗华支睾吸虫CAg噬菌体抗体表达与活性鉴定
目的对从抗华支睾吸虫噬菌体抗体库中筛选到的阳性克隆进行诱导表达和鉴定.方法对阳性克隆株B05、C10和E38用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹试验(Western blot)观察有无Fab抗体条带.然后,用卫氏并殖吸虫(Pw)、肝片吸虫(Fh)、姜片吸虫(Fb)、华支睾吸虫(Cs)、日本血吸虫(Si)脱脂全虫粗抗原和华支睾吸虫代谢抗原(Cs-MAg)进行SDS-PAGE,并分别和B05、C10和E38噬菌体抗体进行Western blot,鉴定抗体活性.结果 Western blot结果表明,3株阳性克隆的培养上清和细菌冻融上清在约50 kD和27 kD处均有特异抗体条带出现.B05噬菌体抗体与Cs-MAg和Cs-Ag在约25 kD处出现特异性反应条带,而与其它4种吸虫抗原无反应条带的出现.C10除与Cs-MAg和华支睾吸虫全虫抗原CsAg)在约38 kD处出现反应条带外,还与Sj-Ag在该处有弱阳性反应;而与其它3种吸虫抗原无反应条带出现.E38与Cs-MAg和Cs-Ag在约16 kD处出现特异性反应条带,而与其它4种吸虫抗原无反应条带出现.结论3株阳性克隆均可表达抗华支睾吸虫循环抗原(CAg)噬菌体抗体,其中B05和E38具有特异结合Cs-CAg活性.
关键词： 华支睾吸虫 循环抗原 噬菌体抗体 Western blot -
乙肝病毒核心抗原人源单链可变区抗体的筛选
目的筛选、鉴定乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)蛋白的人源单链可变区抗体(ScFv)的编码基因,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗HBV的基因治疗研究奠定基础.方法采用噬菌体表面展示技术,以HBcAg蛋白为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得抗原结合活性较强的HBcAg人源单链可变区抗体阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定.结果筛选得到的ScFv片段编码基因为771nt,编码的产物由257个氨基酸残基组成,具有典型的轻链和重链可变区结构特点以及与HBcAg结合的特异性.结论利用噬菌体抗体库技术成功地获得了HBcAg人源单链可变区抗体的编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达.
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抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达
目的:尝试将1株来源于人源性噬菌体抗体库的抗HBsAg人Fa b,转换成完整的抗 HBsAg人IgG.方法:采用重叠PCR方法,在抗HBsAg人Fab的Vκ和VH基因的5'端接上人工合成的人κ链的前导序列,构建表达完整IgG1的真核表达载体,转染CHO(DHFR-)细胞,用ELI S A、RT-PCR和免疫印迹检测抗HBsAg人IgG的表达.通过DHFR/MTX体系及金属离子诱导提高Ig 表达.结果:获得表达量在每24 h 1 μg/106细胞的稳定表达抗HBsAg人IgG的转染细胞系 .并证实所表达IgG具有良好特异性及完整Fc段,其亲和力约为2.1×109 M-1.又通过DHFR/MTX扩增系统的作用及金属离子锌和镉对小鼠金属硫蛋白启动子的激活作用,使IgG 的表达量提高了约20倍.结论:通过拼接人κ链的前导序列在真核表达系统成功地将抗HBsAg人Fab转换成完整的HBsAg人IgG1,为其进一步应用打下了基础.
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用硫氰酸盐洗脱法筛选高亲和力噬菌体抗体
目的:建立一种从抗体库中筛选高亲和力噬菌体抗体的方法.方法:选择已知亲和力高低不同的噬菌体抗体以不同的比例组成模拟抗体库,在常规筛选程序的基础上,用不同浓度的硫氰酸盐进行洗脱,选择性去除低亲和力抗体,保留高亲和力体,对后获得的噬菌体抗体制备质粒DNA进行内切酶谱分析,判断其中高亲和力抗体的比例.结果:实验证明工作浓度硫氰酸盐的孵育不影响噬菌体颗粒的感染活性 ;抗体库筛选过程中用硫氰酸盐进行洗脱,发现随着硫氰酸盐浓度的增加,洗脱回收的噬菌体抗体中高亲和力克隆的比例逐渐升高.结论:硫氰酸盐洗脱法用于噬菌体抗体的筛选有助于成功获得期望的高亲和力抗体.
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从大容量抗体库中筛选抗蓖麻毒蛋白抗体
目的:从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗蓖麻毒蛋白的人源抗体.方法:将蓖麻毒蛋白固定在抗原管上,通过5轮"吸附-洗脱-扩增"过程从大容量抗体库中筛选到特异性抗体,并转染到HB2151菌中,经IPTG诱导,制备抗蓖麻毒蛋白的可溶性单链抗体.结果:经过5轮筛选,获得40个与蓖麻毒蛋白结合的阳性克隆,其中12个特异性结合的克隆,指纹分析有7种不同的可变区片段;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.并将其制备成可溶性的抗体.结论:利用单链大容量抗体库获得抗蓖麻毒蛋白的噬菌体抗体并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定基础.
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人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达
用常规RT-PCR法,直接从5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因,构建噬菌体抗体Fab库.对抗体库进行5轮吸附-洗脱-扩增的亲和选择后,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体.5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达96%.对一阳性克隆在大肠杆菌中表达,经ELISA及Westernblot分析鉴定,证实成功表达出人源可溶性Fab.对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定,证实所获基因为抗体可变区基因.抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具.
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噬菌体抗体库筛选方法的研究进展
建立高效的筛选方法是噬菌体抗体库技术实际应用的主要瓶颈.人们对传统抗体库筛选方法(固相和液相淘筛法)所涉及的抗原表位构象及筛选通量问题做了相应改进,并针对一些天然抗原难以体外制备、或为降低筛选的非特异性、或为达到规模化筛选目的而发展了一些新型的筛选方法(细胞淘筛法、组织或体内淘筛法、选择感染法和自动化淘筛法),同时对影响筛选效率的主要条件参数(封闭与洗脱条件,筛选轮数与严紧度)进行了优化研究.这些研究必将加速抗体库技术快速规模化制备抗体的普及实现.
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抗华支睾吸虫噬菌体抗体库的构建
目的构建抗华支睾吸虫噬菌体抗体库，以期筛选出抗循环抗原的抗体组合。方法应用噬菌体表面呈现技术，从感染华支睾吸虫病人淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA后，用相应引物PCR扩增出重链Fd和轻链基因，经Xho I和Spel、Sac I和Xba I双酶切，先后克隆入噬粒载体pComb3，再电转化大肠杆菌XL1-blue菌株，辅助噬菌体VCSM13超感染。结果从感染华支睾吸虫病人淋巴细胞中扩增出约700bp重链γ1、γ3Fd段和轻链κ、λ基因，分别和pComb3连接后成功导入XL1-blue，得到滴度为7.5×1010cfu／ml，库容量为5.6×106噬菌体抗体库。结论抗华支睾吸虫Fab段噬菌体抗体库的构建，为进一步筛选抗华支睾吸虫循环抗原单克隆抗体奠定了基础。
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全人源抗体制备技术研究进展
抗体是能与相应抗原特异结合的具有免疫功能的球蛋白.1888年 Emile Roux及Alexander Yersin 从白喉杆菌的培养上清液中分离到可溶性毒素,后者注入动物体内可引起典型的白喉发病症状.Von Behring 及其同事Kitasato(北里)报告,以白喉或破伤风毒素免疫动物后,其血中可产生一种中和毒素的物质,能阻止毒素引发疾病.来自实验动物的抗毒素血清用于感染的患儿,获得明显的治疗效果,尤其是在发病的早期.于是将能中和毒素的物质称为抗毒素(antitoxin),后引入抗体一词.
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抗大肠癌噬菌体人单链抗体的初步鉴定及序列分析
目的:对抗大肠癌细胞的单克隆噬菌体单链抗体进行初步鉴定和测序分析.方法:采用细胞ELISA,免疫组化,DNA序列测定和计算机分析方法,对5个单克隆噬菌体抗体(CH273,CH205,CH209,CHA12,CH723)进行初步鉴定和序列分析.结果: 5个抗体均对人大肠癌细胞、人胚肾上皮细胞和其它某些人肿瘤细胞反应,也与人正常肝细胞有弱阳性反应,但不与鼠源性的癌细胞和正常细胞反应.细胞免疫组化进一步证实了ELISA结果的正确性.大肠癌免疫组化对大肠癌组织有特异性的结合反应,而不与正常大肠组织反应.测序结果为CH273 ScFv全长732bp;V,D,J分别属于VH3-30-D1-26-JH3-linker-V1-13-JL2,GenBank序号为AY028777和AY028996;CH205全长366bp, V,D,J分别VH1-46-D6-13-JH3, GenBank序号为AF359365;CH209,CHA12和CH723的ScFv基因完全相同,全长723bp,其VH-DH-JH与CH273 ScFv基因中的VH-DH-JH完全一致,V,D,J分别属于VH3-30-D1-26-JH3-linker-L2-Jκ2, GenBank序号为AF363774.结论:噬菌体抗体具有结合人大肠癌组织和细胞的活性,为进一步开发临床应用人源抗肿瘤抗体和小分子抗体片段奠定基础.
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抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体库的构建
目的构建抗人血管生长素基因工程抗体文库.方法采用PCR等分子生物学实验手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗人血管生长素抗体可变区重、轻链基因,通过噬菌体表面呈现技术表达抗体.结果①获取了抗人血管生长素抗体可变区基因片段(ScFv),②得到了抗人血管生长素基因工程抗体文库.结论本研究建立了一种构建高效抗人血管生长素抗体文库的方法,该抗体库在肿瘤的临床治疗上具有广阔的应用前景.
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肺癌患者噬菌体抗体库的构建及抗肺癌单抗的筛选
目的探索从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库及从中筛选抗肿瘤单抗的可行性.方法从肺癌患者肺门淋巴结提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应扩增免疫球蛋白重链Fd段和κ链基因,以pcomb3H为载体,构建噬菌体抗体库,以2株肺癌细胞对噬菌体抗体库进行6轮亲和筛选,再以人成纤维细胞进行2轮吸附,以筛选出抗肺癌细胞抗体.以细胞ELISA法初步鉴定抗体活性.结果构建成噬菌体抗体库,库容为7.5×107个克隆,κ链和Fd段基因与载体DNA的重组率分别为100%(10/10)和90%(9/10).通过亲和筛选和吸附从中获得了能与肺癌细胞结合的人单抗.结论从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库并从中筛选抗肿瘤单抗是可行的,以肿瘤细胞作抗原从抗体库中筛选抗肿瘤抗体是可取的.
