HIV实验室检测研究进展和发展趋势

随着分子生物学技术的飞速发展,人类免疫缺陷病毒(HIV)的实验室检测技术也在不断更新.本文着重阐述了HIV血清学第四代检测试剂盒的特点,应用抗体亲和力技术估计发病率,荧光实时定量PCR技术的应用以及基因芯片技术的发展趋势.

氯霉素高特异抗体的制备与纯化

目的 自制免疫亲和层析柱,采用亲和层析法获取高纯度的抗氯霉素抗体并对其进行活性分析.方法 采用硫酸铵分级沉淀法对抗体进行初步提取.然后选用3,3'-二氨丙基亚胺(DADPA)作为亲和凝胶与配基氯霉素之间的"间隔臂",制备分离纯化抗氯霉素特异性IgG的亲和层析柱,对IgG粗品进行亲和层析纯化,并用ELISA法检测其活性.结果 经饱和硫酸铵分级沉淀,可除去大部分的杂蛋白,较好实现对目标蛋白的初步分离;采用自制的免疫亲和层析柱,可获得高纯度的兔抗氯霉素抗体,检测其活性比纯化前提高了4倍,交叉反应结果显示抗体对CAP有高的特异性,对其他类似药物无反应活性.结论 应用本试验所建立的方法可得到高纯度的抗氯霉素抗体,为氯霉素的免疫检测奠定了基础.

IgG抗体亲和力方法用于鉴别麻疹原发和继发性免疫失败

目的 探讨麻疹消除阶段IgG抗体亲和力应用于区分原发和继发性免疫失败麻疹病例的意义.方法 采用酶联免疫吸附方法检测92例麻疹诊断病例(其中17例为一起学校麻疹暴发疫情病例)的血清IgM和IgG抗体水平,测定IgG抗体亲和力,计算相对亲和力指数.结果 17例暴发疫情病例的血清IgM阳性率为41.18％ (7/17),IgG阳性率为100％ (17/17),全部为高亲和力IgG抗体.在另75例IgM阳性病例中,IgG阳性率为76.00％(57/75),有高亲和力IgG抗体的病例占61.4％(35/57).92例病例中未接种含麻疹成分疫苗(MCV) 25例,有高亲和力IgG抗体的病例占48％ (12/25);22例病例接种≥1剂MCV,有高亲和力IgG抗体的病例占77.27％ (17/22).MCV接种病例中继发性免疫失败麻疹病例17例,原发性免疫失败麻疹病例5例.结论 麻疹IgG抗体亲和力测定可用于鉴别麻疹原发和继发性免疫失败病例,解决了中国消除麻疹的这一关键技术问题.

抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

目的制备抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体并研究其初步应用.方法用基因重组N蛋白免疫小鼠,取免疫后的鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体细胞株.将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对抗体进行纯化,分析纯化抗体的相对亲和力.选择亲和力较高的抗体制备检测SARS病毒抗原的酶联免疫诊断试剂,并对其敏感性和特异性进行分析.结果共获得11株单克隆抗体细胞株,其中3株单抗与N蛋白具有较高的亲和力,4株纯化单抗与N蛋白反应很弱,其余4株单抗介于两者之间.用亲和力较高的单抗制备检测SARS病毒抗原的诊断试剂,其敏感性可达31 PFU/ml,而且与其他呼吸道病毒无交叉反应.结论该试剂特异性较好,可用于SARS病毒抗原的检测,其敏感性仍需用临床急性期样品进行评价.

抗双链DNA抗体IgG的亲合力及亚类在狼疮性肾炎疾病中的分布情况及作用初探

目的 探讨抗双链DNA (dsDNA)抗体IgG的亲合力及亚类在狼疮性肾炎(LN)疾病患者中的分布情况以及与肾脏受累之间的关系.方法 病例对照研究.选择2012年2月至2014年5月于北京大学第一医院就诊,初次诊断为LN的148例患者进行研究,其中91例为肾脏内科住院患者,行肾脏活检穿刺术.用酶联免疫吸附法检测受试者血清IgG型抗dsDNA抗体亲合力及亚类.以肾脏活检结果作为LN肾脏受累分级的依据.记录受试者肾脏病理分级、肾脏病理活动性指数(AI)、慢性指数(CI)、系统性红斑狼疮疾病活动度评分(SLEDAI)评分以及其他各项实验室检查包括外周血白细胞计数、尿红细胞计数、尿蛋白定量、血肌酐、血清C3等系统性红斑狼疮(SLE)疾病活动度的指标,与受试者抗dsDNA IgG抗体亲合力、亚类等进行Spearman相关性分析.结果 LN患者的抗dsDNA抗体亲合力指数中位数水平为33.7(19.2 ～51.1).针对抗dsDNA抗体酶联免疫吸附法阳性患者,间接免疫荧光法阳性组的亲合力指数要显著高于间接免疫荧光法阴性组(H =15.13,P=0.0001).抗dsDNA抗体以IgG3亚类为主(24例,26.4％),其次为4种亚类同时阳性(10例,11.0％).将抗dsDNA抗体亲合力及亚类与各项肾脏受累指标及其他实验室指标做相关分析,抗dsDNA抗体亲合力与所有指标均不相关,IgG3亚类与肾脏活动性指数AI呈明显负相关(R=-0.42,P=0.03).结论 抗dsDNA抗体IgG的亲合力与LN肾脏受累不相关,IgG3亚类是LN患者的主要亚类,与肾脏的活动性指数明显相关,有可能作为LN肾脏受累的间接证据应用于临床.

人巨细胞病毒pp65 IgG亲和指数在人巨细胞病毒原发感染小鼠模型中的标志作用

目的 通过对人巨细胞病毒(human eytomegalovims,HCMV)原发感染BALB/c模型小鼠感染状态的实验研究,探索检测HCMV pp65 IgG亲和指数(avidity index,AI)在原发感染诊断中的意义和作用.方法 取6～8周龄SPF(Specific Pathogen Free)级BALB/c雌性小鼠30只,分为5组,每组6只,分别用2×105、2×105、2×104、2×103和2×102PFU/ml的5个剂量的病毒悬液腹腔注射小鼠,1.0 ml/只;另取浓度为2×106PFU/ml剂量的病毒,经56℃30 min灭活后,1.0 ml/只腹腔注射雌性小鼠共6只,作为灭活对照组;同株同代的HF细胞悬液1.0 ml/只腹腔注射雌性小鼠共6只,作为HF细胞对照组.各组小鼠于屏障系统内饲养1个月后,检测小鼠的感染状态.病毒分离检测脑、肺组织中感染性病毒颗粒,观察HCMV特异性细胞病变效应,PCR试验检测细胞培养物UL83基因,间接免疫荧光试验检测细胞玻片pp65抗原;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测小鼠脑、肺组织中HCMV pp67的转录;同时,用本室自制的截短pp65抗原制备的ELISA试剂盒检测血清标本中HCMVpp65特异性IgM抗体和IgG-Al.结果 2×104PFU/ml和2×105PFU/ml剂量的病毒感染小鼠后,脑、肺组织中均可检测到感染性病毒颗粒,感染率均为100%;RT-PCR均可检测到小鼠脑、肺组织中pp67转录产物;血清学检测这两组小鼠HCMV pp65 IgM均为阳性,HCMV pp65 IgG-AI＜50%;检测结果判断该两组小鼠为HCMV原发感染.余低剂量病毒组、灭活病毒组和人胚成纤维细胞(HF)对照组检测结果均为阴性.结论 HCMV AD169株可感染BALB/c小鼠,初次感染病毒1个月后可表现原发感染状态;以HCMV pp65重组蛋白为抗原榆测特异性IgM抗体以及相应IsG-AI间接ELISA法,可作为对HCMV原发感染的初筛手段,是诊断HCMV原发感染有效的方法之一.

HIV新发感染检测技术研究进展

2001年“美国CDC艾滋病免疫和诊断室”评估了16种基于不同抗体和原理的HIV-1新近感染检测方法,发现新近感染者与既往感染者相比,各种抗体滴度均较低,其中gp 41抗体滴度在新近感染者和既往感染者中的差别大,两者的滴度区间几乎没有重叠,新近感染者的gp41抗体亲和力低于既往感染者,从而认为gp 41抗体能够区分新近感染者和既往感染者.围绕上述特点进行了大量研究,旨在寻找一种能正确估计新发感染率的检测计算方法.本文就此作一综述,以期深入全面了解这一检测技术的发展和应用.

非竞争性ELISA法测定人源抗HBsAg Fab功能性亲和常数

目的测定完全人源化基因工程抗体HBsAg Fab的亲和常数.方法采用非竞争性ELISA固相法,经确定佳抗原包板浓度、佳抗原包板时间及佳抗原与抗体结合反应时间后,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAg Fab及完整抗体抗HBsAg IgG的抗原抗体结合反应曲线,计算出抗HBsAg Fab及抗HBsAg IgG的亲和常数.结果人源基因工程抗体抗HBsAg Fab的功能性亲和常数在107～108M-1水平,比完整抗HBsAg IgG仅仅小约1个数量级(108～109M-1).结论该基因工程抗体与抗原结合能力较强,为今后开发应用Fab进行生物导向治疗提供了理论基础.

affibody分子:一类具有高度亲和力的新配体

affibody分子是一类新的由58个氨基酸残基组成、相对分子质量约为6.5×103的亲和性配体,其功能类似于抗体却又有着一些抗体所不具备的性质,如相对分子质量小、折叠速率快、选择性和亲和力高,以及结构稳定,可耐受化学修饰等,因此被称为“人工抗体”.近年来affibody分子在生物科学的许多领域中得到广泛应用,本文综述了affibody分子的起源、特点及其在影像诊断和治疗学方面的研究进展和应用现状,并对其在药物载体方面的应用前景进行了展望.

海洛因依赖患者血清吗啡多抗与阿片类物质结合特异性的鉴定

目的 通过对海洛因依赖患者来源的吗啡多抗与多种阿片类物质的结合特异性的研究,分析人源化吗啡抗体识别抗原的关键结构.方法 竞争ELISA法观察海洛因依赖患者血清中吗啡多抗与9种阿片类物质的结合特异性.结果 吗啡多抗与吗啡、海洛因、可待因及吗啡-葡萄糖醛酸苷等阿片受体激动剂有较强的结合性,大竞争抑制率达到80%～100%,IC50值在1～100 μmol·L-1之间;但与[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-脑啡肽和拮抗剂纳洛酮及纳曲酮没有结合.在激动剂中,与抗体亲和力较强的化合物结构均与吗啡相似(6-位醇羟基);美沙酮、羟考酮、埃托啡等6-位取代结构变化较大,与抗体的亲和力也较弱,大竞争抑制率仅有50%～75%.结论 吗啡抗体主要识别的结构是阿片受体激动剂的活性基团N-甲基,同时分子结构中3-位或6-位取代基对抗体识别也有一定影响.

人p53四价功能域对提高抗体功能性亲和力的作用

目的探讨人p53四价功能域在提高抗体功能性亲和力和生物学活性方面的的作用.方法利用基因克隆技术,将人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因与前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体基因融合,构建多价抗体(mBsAb),测序正确后,将其亚克隆入真核表达载体进行表达,纯化表达产物,并利用流式细胞仪及51Cr释放试验进行生物学活性测定.结果经酶切、测序分析证实mBsAb构建成功,其真核表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子量为67 000,mBsAb与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为70.4%和81%,明显高于BsAb组.51Cr释放试验结果显示, mBsAb激活的T细胞可以裂解PC-3细胞,裂解百分率明显高于IL-2组和BsAb组.结论人IgG3上游铰链区/p53四价功能域基因与抗前列腺癌/抗人CD3双特异性单链抗体基因融合后表达产物的功能性亲和力和生物学活性大大提高,为提高抗体的功能性亲和力和生物学活性开辟了新的思路.

肝细胞膜上β2糖蛋白Ⅰ受体的鉴定

目的 鉴定肝癌细胞株SMMC-7721细胞膜上与β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)特异结合的蛋白及其功能.方法 应用自制的β2GPⅠ亲和柱,将制备的肝脏细胞多聚核糖体提取液过柱,使β2GPⅠ特异结合蛋白的多聚核糖体及其mRNA复合体结合其上,并洗脱收集.将洗脱液用cDNA合成试剂盒及cDNA PCR试剂盒处理得到相应的DNA,并测序分析.逆转录PCR从肝细胞株SMMC-7721中扩增膜联蛋白Ⅱ.流式细胞术检测膜联蛋白Ⅱ与β2GP Ⅰ-GFP对SMMC-7721的竞争结合.结果 获得的β2GPⅠ特异结合蛋白cDNA片段约为1.1kb,与人膜联蛋白Ⅱ具有高度同源性(98%).SMMC-7721中有膜联蛋白Ⅱ的表达,并且1μl及4μl的膜联蛋白Ⅱ分别可使β2GP Ⅰ-GFP与SMMC-7721的结合率由15.58%降至13.66%和7.56%.结论 β2GP Ⅰ在肝细胞膜上的受体是膜联蛋白Ⅱ,它可与β2GP Ⅰ-GFP竞争结合SMMC-7721.βzGPⅠ可能通过膜联蛋白Ⅱ介导HBV入侵肝细胞.

微量元素与人体免疫功能

免疫功能正常可以抵御很多细菌和病毒的侵害,是人体健康的表现,反之,则容易生病.营养与免疫存在着内在联系这一点已被人们所熟知,而微量元素往往在其中起着重要作用.在过去的30年中,世界范围的系统研究证实,能量、常量营养素摄入不足和(或)某些特殊的微量元素缺乏所导致的营养低下可以削弱免疫系统.主要表现在细胞免疫、补体系统、吞噬细胞功能、细胞因子产物、黏膜的分泌、抗体反应及抗体亲和力等方面.

高亲和力抗双链DNA抗体检测在系统性红斑狼疮诊断中的意义

目的 比较不同亲和力的抗dsDNA抗体在SLE诊断中的临床意义.方法 用ELISA检测431份血清中总抗dsDNA抗体(包括高亲和力和低亲和力抗dsDNA抗体)与高亲和力抗dsDNA抗体水平.收集标本时,评价SLE患者的M-SLEDAI得分.采用x2检验、Spearman相关、Mann Whitney U检验和Fisher exact方法、Student t检验.结果 ①所有血清总抗dsDNA抗体与高亲和力抗dsDNA抗体的总的一致性为93.3％; SLE患者总抗dsDNA抗体与高亲和力抗dsDNA抗体一致性为89.6％,有23例SLE患者总抗dsDNA抗体阳性而高亲和力抗dsDNA抗体阴性,其中22例(占95.7％)的M-SLEDAI评分＜4分;4例其他CTD患者血清总抗dsDNA抗体阳性,而高亲和力抗dsDNA抗体阴性.②SLE患者血清总抗dsDNA抗体(r=0.57,P＜0.01)以及高亲和力抗dsDNA抗体水平(r=0.59,P＜0.01)均与M-SLEDAI评分呈正相关,与血清中补体C3(r=-0.50,P＜0.01;r=-0.54,P＜0.01)和C4(r=-0.50,P＜0.01;r=-0.50,P＜0.01)水平呈相关.③M-SLEDAI评分≥4分的患者血清中高亲和力占总抗dsDNA抗体的比例显著高于M-SLEDAI评分＜4分的患者.伴肾脏损害患者高亲和力抗dsDNA抗体所占比例显著高于不伴肾脏损害的患者.结论 血清中总抗dsDNA抗体和高亲和力抗dsDNA抗体水平均与SLE病情活动性以及肾脏损害相关,但是高亲和力抗dsDNA抗体对活动性SLE患者更具有特异性,也更有助于SLE与其他自身免疫病鉴别.检测血清中高亲和力抗dsDNA抗体比检测总抗dsDNA抗体更能客观了解SLE的受累状况.

滤泡辅助性T细胞的研究进展

生发中心（ Germinal center ， GC ）是次级淋巴组织（如淋巴结、脾、扁桃体、Peyer 斑）淋巴滤泡中的特殊结构。在GC内B细胞经历克隆增殖、体细胞高频突变、抗体类别转换、抗体亲和力成熟等过程，终分化为长寿命记忆性B细胞和浆细胞。

用硫氰酸盐洗脱法筛选高亲和力噬菌体抗体

目的:建立一种从抗体库中筛选高亲和力噬菌体抗体的方法.方法:选择已知亲和力高低不同的噬菌体抗体以不同的比例组成模拟抗体库,在常规筛选程序的基础上,用不同浓度的硫氰酸盐进行洗脱,选择性去除低亲和力抗体,保留高亲和力体,对后获得的噬菌体抗体制备质粒DNA进行内切酶谱分析,判断其中高亲和力抗体的比例.结果:实验证明工作浓度硫氰酸盐的孵育不影响噬菌体颗粒的感染活性 ;抗体库筛选过程中用硫氰酸盐进行洗脱,发现随着硫氰酸盐浓度的增加,洗脱回收的噬菌体抗体中高亲和力克隆的比例逐渐升高.结论:硫氰酸盐洗脱法用于噬菌体抗体的筛选有助于成功获得期望的高亲和力抗体.

联合应用错配PCR和交替延伸PCR法提高抗TNFα抗体亲和力

目的:通过突变方法提高抗TNFα单链抗体pscTNF的亲和力.方法:以pscTNF质粒为模板,应用错配PCR构建突变抗体库,筛选亲和力得到改善的变种,再以所获变种为模板,用交替延伸PCR技术,再次构建突变库,筛选活性得到改良的克隆.以斑点ELISA方法及硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善.结果:从错配PCR抗体库中筛选得到7个活性有所增强的变种,再通过交替延伸PCR使这7个变种的突变位点交换重组,获得了亲和力进一步提高的克隆.结论:联合应用错配PCR和交替延伸PCR法可提高单链抗体亲和力.

应用ELISA方法计算抗体亲和力的研究进展

主要介绍了用ELISA方法计算不同情况的抗体亲和力.

单价B群脑膜炎奈瑟菌OMV疫苗免疫后的抗体亲和力及其IgG亚型

抗体药物的设计及其研究进展

先进的展示技术为重组抗体的筛选和改造提供了有效而灵活的方法.通过展示技术可以获得更适用于诊断和治疗的优化分子,而后者不能直接通过动物免疫接种的方式获得.展示技术可通过自动化或与新一代测序技术和阵列技术联合应用得到进一步提高,形成高通量筛选技术平台,用于筛选多种对应大量基因组编码靶标的抗体.从头设计抗体已开始成为制造新抗体的一种策略,但仍具有技术挑战性.然而,抗体-抗原结构数据库的不断增加和计算工具的不断开发,都表明这些挑战是可以克服的.预计未来以物理分子模拟知识为基础的计算方法,将成为提高抗体设计准确性和成功性的主要驱动力.