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HIV实验室检测研究进展和发展趋势
随着分子生物学技术的飞速发展,人类免疫缺陷病毒(HIV)的实验室检测技术也在不断更新.本文着重阐述了HIV血清学第四代检测试剂盒的特点,应用抗体亲和力技术估计发病率,荧光实时定量PCR技术的应用以及基因芯片技术的发展趋势.
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荧光实时定量PCR技术及其在耐多药结核病快速诊断中的应用
耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculo-sis.MDR-TB)是指结核病患者排出的结核菌至少对包括利福平和异烟肼2种或以上药物产生耐药.由于结核病的标准治疗方案是建立在利福平和异烟肼为主要抗结核药物基础上的多种药物联合治疗方案,因此对耐多药结核病的药物治疗作用不佳,标准方案治疗有效率明显下降,死亡率较高[1].
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HIV-1 Tat协同HHV-6感染激活HHV-8增殖周期复制
含HIV-1 Tat基因的重组表达质粒通过基因转染方法分别转染JJhan细胞(T淋巴细胞系)、HHV-6感染的JJhan细胞、BCBL-1细胞(HHV-8阳性、EBV阴性细胞系)和HHV-6感染的BCBL-1细胞,再将转染前后的JJhan细胞及HHV-6感染的JJhan细胞分别与BCBL-1细胞用Transwell共培养系统进行共培养,通过荧光实时定量PCR检测HHV-8次要衣壳蛋白编码基因ORF26 mRNA转录,以评价胞内、外HIV-1 Tat单独作用或与HHV-6组合对HHV-8增殖周期复制的影响.
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荧光实时定量聚合酶链反应检测非小细胞肺癌中胎盘生长因子基因表达状态的研究
在对肿瘤复发转移机制的研究中,人们逐渐认识到新生血管生成在肺癌生长和发展过程中起重要作用[1].血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知的诱导血管生成作用强的调节因子[2].我们前期研究已证实,VEGF与肺癌发生发展相关[3,4].胎盘生长因子(PIGF)是VEGF家族的重要成员[5],在食管癌、结直肠癌、胃癌、黑色素瘤、头颈部鳞癌和肾癌等[6-10]实体肿瘤中表达上调,但鲜见肺癌RNA水平表达的报道.
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丹芍化纤方对体外大鼠肝细胞增生、Caspase-3mRNA及白蛋白合成的影响
目的:探讨丹芍化纤方抗肝纤维化的作用机制.方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法,分离、培养大鼠肝细胞,加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞,用MTT法测定肝细胞的增生,荧光实时定量PT-PCR(Real Time RT-PCR)法检测肝细胞内天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测培养上清中的白蛋白.结果:丹芍化纤方药物血清对肝细胞的增生及白蛋白合成有促进作用,能显著下调肝细胞内caspase-3mRNA的表达,其表达水平与正常大鼠血清组比较有显著性差异,呈明显的浓度依赖关系.结论:丹芍化纤方发挥抗肝纤维化作用与其促进肝细胞增生、蛋白合成功能,抑制肝细胞凋亡有关.
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消瘢方对体外CCl4损伤大鼠原代肝细胞保护作用的研究
目的:探讨消瘢方抗肝纤维化作用的机理.方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Hcoll密度梯度离心的方法,分离、培养大鼠肝细胞,先加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞24 h,再用四氯化碳(CCl4)蒸熏法制造肝细胞损伤模型.分别用MTT法及荧光实时定量RT-PCR法检测CCl4损伤后肝细胞的增殖、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测细胞培养上清中的谷草转氨酶(AST)活性.结果:消瘢方药物血清能显著地促进CCl4损伤后肝细胞的增殖(P<0.05,P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞内有一定量的caspase-3mRNA表达(6.96±0.69 ng),加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,肝细胞caspase-3mRNA的表达(6.31±0.64,6.01±0.68,5.54±0.58 ng)稍低于CCl4损伤模型,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,肝细胞caspase3mRNA的表达(5.51±0.72,4.87±0.45,3.08±0.82 ng)显著下调(P<0.05,P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞培养上清中AST活性为1203.91±86.85 nkat,加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,其培养上清中AST活性降低为1092.39±57.01,1025.54±29.17,996.03±53.68 nkat,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,其培养上清中AST活性(998.70±30.67,885.51±44.82,753.48±35.17nkat)显著降低(P<0.05,P<0.01).消瘢方药物血清对CCl4损伤后肝细胞增殖的影响、下调肝细胞caspase-3mRNA的表达及降低肝细胞培养上清中AST活性的作用,均呈明显的血清浓度依赖关系.结论:消瘢方抗肝纤维化机理与其保护肝细胞免受损害、抑制肝细胞凋亡有关.
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肝细胞生长因子对卵巢癌细胞侵袭作用的影响
肝细胞生长因子(HGF)与其受体c-met蛋白特异性结合,可激活多条信号传导通路的级联反应,促进细胞增殖、肿瘤血管形成、肿瘤细胞的侵袭等.为了解HGF对卵巢癌细胞浸润转移的促进作用及其对卵巢癌细胞核转录因子(NFκB)通路的传导作用,采用Boyden小室体外侵袭实验观察HGF对卵巢癌细胞株SKOV3细胞侵袭作用的影响,荧光实时定量RT-PCR技术检测其相关基因明胶酶B(MMP9)的表达,间接免疫荧光法检测HGF对SKOV3细胞的NFκB活性的影响.结果显示,HGF(40 ng/ml)处理SKOV3细胞后,侵入基底膜的细胞数[(382±10)个]明显高于未处理者[(176±10)个],差异有统计学意义(P<0.01).HGF处理后,SKOV3细胞中MMP9 mRNA表达水平较未处理者升高5.6倍(P<0.01),经NFκB 抑制剂PDTC处理后再用HGF处理的SKOV3细胞中MMP9 mRNA表达水平只升高了2.7倍(P<0.05).
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HIV实验室检测概况
目前,HIV血清学诊断仍然是艾滋病早期诊断的主要依据[1],随着分子生物学技术的飞速发展,HIV检测技术也正发生着日新月异的变化.从聚合酶链反应(PCR)技术应用于HIV的检测,到荧光实时定量PCR的应用,再到生物芯片的应用,每一步变化都给人们带来惊喜,都使人们对未来检测HIV的前景充满信心.现就近年来HIV检测概况作一综述.
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急性白血病患者p15与p16基因甲基化检测及mRNA表达水平的定量分析
近年研究发现肿瘤细胞中存在DNA甲基化分布异常.即在肿瘤细胞中同时还存在基因组某些区域,特别是在一些抑癌基因的启动子区域高甲基化现象.抑癌基因启动子及转录起始区高甲基化可能也是导致抑癌基因失活和细胞恶性转化的机制之一[1].抑癌基因p15(CDK2B)和p16(CDK2A)均位于人类9号染色体短臂(9p21),编码两种细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制性蛋白,参与细胞增殖与分化的调节[2,3].为探讨p15与p16在白血病细胞的甲基化状态及与表达水平的关系,我们应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术检测40例初诊急性白血病(AL)患者p15和p16甲基化状态,同时用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-QPCR)技术检测p15和p16基因mRNA表达水平.
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同时检测WT1和mdr1基因多重荧光实时定量PCR标准品的构建
绝大多数急性白血病患者存在WT1基因异常高表达,其异常表达程度也与难治复发白血病有关,并可作为"泛白血病"标志检测指标监测微量残留病(MRD)[1-3].近有研究发现急性白血病mdr1和WT1基因表达水平有明显的相关性[4],但目前国内外研究一般是分别对WT1和mdr1基因进行单独检测,操作繁琐且不能准确了解同一标本两者的关系.多重荧光实时定量PCR是指在PCR体系中加入多个荧光基团,设计不同的引物在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增,通过连续监测不同荧光信号强度的变化来实时监测不同待测基因的表达量,后通过标准曲线对不同未知起始模板进行定量分析的方法.
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垂体瘤转化基因在原发性肝癌中的表达及其与预后不良的关系
肝癌是全世界范围的高发恶性肿瘤,其发生是多基因、多步骤、多阶段的复杂过程[1].对于肝癌的发病机制,目前普遍认为与癌基因的激活、抑癌基因的失活及染色体的非整倍体的出现、细胞周期及细胞周期调节点失控关系密切.垂体瘤转化基因( PTTG1)是细胞周期调节蛋白,能抑制姐妹染色单体分离,导致染色体不稳定,形成非整倍体.在成人大多数正常组织中PTTG1表达较弱,甚至检测不到,而在垂体肿瘤、肺癌、乳癌、结肠癌、食管癌等肿瘤细胞中均有高表达[2].PTTG1可能是一种潜在的抗癌基因治疗靶点[3].本研究应用荧光实时定量PCR、免疫组织化学、Western blot方法检测65例配对的肝细胞癌及其癌旁组织中PTTG1表达情况,并分析PTTG1蛋白与血管内皮生长因子(VEGF)及临床指标的相关性.
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HIV检测技术的研究进展
获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome)简称艾滋病(AIDS),已成为危害全球的一种严重传染性疾病.截止2003年12月,联合国艾滋病规划署估计全世界艾滋病病毒(HIV)感染者约4 000万,HIV感染者和艾滋病患者死亡人数约300万[1].我国AIDS的流行也呈加速发展趋势.目前,HIV血清学诊断仍然是艾滋病早期诊断的主要依据[2],而随着分子生物学技术的飞速发展,HIV检测技术也正发生着日新月异的变化.从聚合酶链反应(PCR)技术应用于HIV的检测,到荧光实时定量PCR的应用,再到生物芯片的应用,每一步变化,都给人们带来惊喜,都使人们对未来检测HIV的前景充满信心.现就近年来HIV检测的研究进展作一综述.
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慢性胃炎及胃癌组织中膜联蛋白A1 mRNA 的表达变化及意义
目的:观察慢性胃炎及胃癌组织中膜联蛋白A1( ANXA1) mRNA 的表达变化,并探讨其临床意义。方法采用q-PCR方法检测40例胃癌组织、20例慢性胃炎组织中的ANXA1 mRNA,并分析其与胃癌临床病理参数的关系。结果在胃癌组织中90%(36/40)高表达ANXA1 mRNA,慢性胃炎组织中75%(15/20)高表达,P>0.05。 ANXA1 mRNA表达与胃癌临床病理特征之间无显著相关性(P均>0.05)。结论 ANXA1 mRNA在胃癌组织及慢性胃炎组织中均高表达,慢性胃炎与胃癌的发生发展可能有潜在相关性。
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Chk1在ST诱导GES-1细胞G2/M期阻滞中的作用
目的:研究Chk1在杂色曲霉素(sterigmatocystin,ST)诱导人胃黏膜上皮细胞(GES-1)G2/M期阻滞中的作用。方法:采用流式细胞术(FCM)、荧光实时定量PCR(real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)等方法,观察不同浓度ST(3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L)处理24 h后,体外培养GES-1细胞周期分布、Chk1及p-Chk1的表达;随后给予Chk1 siRNA干扰后,观察细胞周期分布的变化。结果:FCM结果提示ST能够诱导GES-1细胞发生G2/M期阻滞;real-time PCR结果显示ST可以提高Chk1在mRNA水平的表达;Western blot结果显示ST可以增加Chk1及p-Chk1的蛋白表达;FCM结果显示与control siRNA+ST处理组相比,Chk1 siRNA+ST处理组G2/M期细胞比例明显下降( P<0.05)。结论: Chk1的激活是ST引发GES-1细胞G2/M期阻滞的重要原因。
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实时荧光定量PCR检测黑参对S180荷瘤小鼠TNF-α mRNA表达的影响
目的 实时荧光定量PCR检测黑参对S180肿瘤模型小鼠TNF-αmRNA表达的影响,应用分子生物学手段分析黑参抑制肿瘤的机制.方法 采取腋下注射S180肿瘤细胞制得小鼠肿瘤模型,随机分成空白对照组、环磷酰胺组、消癌平组、红参高剂量组、红参中剂量组、红参低剂量组、黑参高剂量组、黑参中剂量组和黑参低剂量组.除空白对照组外,其他实验组均采取同时灌胃给药.测定小鼠给药前后体重、给药后瘤重,计算抑瘤率,利用IDTDNA设计引物,应用实时荧光定量PCR检测不同组TNF-α表达丰度.结果 与空白对照组相比,所有实验组肿瘤质量都有所减少.除消癌平和环磷酰胺外,使用高剂量黑参和低、中剂量红参对肿瘤重量的抑制较为显著(P<0.01).实时荧光定量PCR显示,同对照组及其他实验组相比,高剂量黑参组和低剂量红参组TNF-α表达量上调(P<0.01,P<0.05).结论 综上,使用高剂量黑参和低剂量红参能够提高小鼠TNF-α转录表达水平并减少肿瘤重量,其中高剂量黑参组效果更明显.