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获得重构基因的简捷方法--重叠延伸PCR
目的:构建IFN-β信号肽序列与白细胞介素18(IL-18)成熟肽的重组嵌合分子.方法:从BALB/c鼠基因组DNA扩增IFN-β信号肽序列;由小鼠Pro-IL-18真核表达质粒获得IL-18成熟肽序列;以非对称PCR技术得到IFN-β信号肽编码区的反义链和IL-18成熟肽正链;采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)产生具有IFN-β信号肽与IL-18成熟肽的嵌合编码序列;定向连方式构建嵌合IL-18的表达质粒并测序.结果:连续胶PAGE表明非对称PCR可分别扩增出两个靶序列的特异性单链,大小符合预期.IFN-β信号肽对称PCR产物与IL-18非对称PCR产物混合作为模板,进行重叠延伸;电泳分析可见清晰的嵌合片段;测序显示重组质粒的表达框由两个设计的靶序列构成,且无移码.结论:重叠延伸PCR是一种获得重构基因的简捷方法.
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非对称PCR-FP技术同步检测HSV-1/-2、CMV和EBV
目的 应用非对称PCR-荧光偏振(FP)技术建立一种同步检测全血中4种主要疱疹病毒(单纯疱疹病毒1/2型,巨细胞病毒、EB病毒)的新方法.方法 以人疱疹病毒属通用引物行非对称PCR,扩增从179例样本中抽提的DNA.PCR扩增产物与特异性单纯疱疹病毒1/2型(HSV-1/2)、巨细胞病毒(CMV)和EB病毒(EBV)寡核苷酸探针混合物温育杂交,荧光偏振检测技术检测杂交液荧光偏振值,据荧光偏振值判断病毒感染类型,并以DNA序列测定结果为参照.结果 与DNA序列测定的阳性检测符合率为100%,但DNA序列测定检测均未检出多重混合感染.非对称PCR-FP方法对HSV-1/-2检测的灵敏度达到1.0×10~3拷贝/ml,时EBV和cMV检测的灵敏度达到2.0×10~3拷贝/ml.结论 本法对于4种主要疱疹病毒感染的筛查及预防、预后判断具重要价值.
