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人β防御素4基因的合成及其真核表达载体的构建
人类β防御素(human β defensin,HBD)是一类具有广谱抗微生物活性的小分子抗菌肽,具有杀伤细菌、真菌、病毒、原虫、肿瘤细胞以及免疫调节等多重活性,而且其作用机制独特,至今尚未发现病菌株对其产生耐药性,因此成为国内外众多学者研究的热点[1-6].
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Kir2.1/ Kir2.3嵌合体的构建与表达
目的 构建Kir2.1/ Kir2.3通道嵌合体,为进一步研究Kir2.1和Kir2.3通道的调控机制打下基础.方法 利用重叠延伸PCR方法构建不同的Kir2.1/ Kir2.3嵌合体质粒:N1P3C3,N3P1C1,N3P3C1,N1P1C3,NIP3C1,N3P1C3.将不同的嵌合体质粒分别用NheI线性化后,转录为cRNA表达于非洲爪蟾卵母细胞,用双电极电压钳记录电流.结果 不同的Kir2.1/ Kir2.3嵌合体质粒构建成功,在非洲爪蟾卵母细胞上可以记录到电流表达.结论 成功构建Kir2.1/ Kir2.3嵌合体并完成了嵌合体通道的异源性表达和电压钳记录.
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野生型及突变型人血管内皮生长因子A真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建人野生型和c.454C>T突变型血管内皮生长因子A(VEGFA)真核表达载体.方法:采用反转录聚合酶链反应扩增人VEGFA基因,用限制性核酸内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切后连接真核表达载体pEGFP-N1,构建野生型VEGFA真核表达载体(野生型pEGFP-VEGFA),通过双酶切和测序进行鉴定.采用定点诱变PCR技术构建c.454C>T突变型人VEGFA真核表达载体(突变型pEGFP-VEGFA),同样通过双酶切和测序进行鉴定.结果:野生型和突变型pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp 两条条带.测序结果证实野生型pEGFP-VEGFA VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致,突变型pEGFP-VEGFA除第454位碱基C被T替代以外,其余序列与野生型完全一致.结论:成功构建了野生型和突变型pEGFP-VEGFA,为下一步研究VEGFA基因功能提供参考.
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小鼠β防御素1与甲型流感病毒M2e融合基因表达及其免疫特性研究
目的 构建mBD1与M2e融合基因的真核表达载体,并检测其在MDCK细胞中的表达情况,初步探讨其免疫特性.方法 利用PCR方法分别扩增mBD1与M2e基因片段,再通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将mBD1与M2e通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD1-M2e.将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)获得重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光、RT-PCR产物序列分析检测融合蛋白表达情况,后采用MTT法检测mBD1-M2e融合蛋白刺激淋巴细胞增殖能力.结果 经鉴定后证实构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,该细胞培养上清液能刺激淋巴细胞增殖.结论 本研究成功构建mBD1-M2e融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,这一结果为进一步研究新型高效通用的流感病毒核酸疫苗奠定了坚实的基础.
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重叠延伸PCR法构建β地中海贫血基因突变质粒标准品
目的:构建含β地中海贫血(简称β地贫)-28(A ＞G)与IVS-2-654(C ＞T)突变基因的质粒标准品.方法:以含β珠蛋白野生型基因的质粒DNA为模板,采用重叠延伸PCR( Overlap extension PCR,OE-PCR)定点诱变后行TA克隆的方法分别构建含-28(A ＞G)与IVS-2-654(C＞T)突变基因的质粒.结果:DNA测序表明:重组质粒1的确含β地贫-28(A＞ G)突变基因,β珠蛋白-28处的碱基已由A突变成G,其余序列与野生型完全相同;重组质粒2的确含IVS-2-654(C ＞T)突变基因,β珠蛋白IVS-2-654处的碱基已由C突变成T,其余序列与野生型完全相.成功实现了定点诱变.结论:分别成功地构建了含β地贫-28(A ＞G)与IVS-2-654(C＞T)突变基因的质粒标准品,进一步为HRM技术检测β地贫基因突变方法的建立及该病其它基因诊断与筛查技术的研究奠定了实验基础.
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A546D突变型TGFBI基因真核表达载体的构建及体外表达
目的 构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体和体外转染体系,为研究野生型及A546D突变型TGFBI基因的功能提供实验基础.方法 应用重叠延伸PCR法定点诱变,构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人角膜上皮(human corneal epithelium,HCE)细胞,Western Blot法检测转染后培养基中HCE细胞分泌的TGFBI蛋白的表达.结果 重组质粒总长约7.5 kb,由HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切鉴定产生5.4 kb和2.1 kb两条片段者为克隆正确质粒.测序鉴定证实了TGFBI基因编码区完整插入到载体pcDNA3.1的多克隆位点中,突变载体的第1685位碱基由C替换为A,使其编码的第546个氨基酸由Ala突变为Asp即A546D突变.野生型及A546D突变型载体转粢入HCE细胞后,TGFBI蛋白有效表达.结论 成功构建了A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,为TGFBI基因相关性角膜营养不良致病机制的研究奠定了基础.
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重叠延伸PCR法构建人肿瘤坏死因子前体水解酶系列突变重组体及稳定转染HeLa细胞株的建立
目的 构建人肿瘤坏死因子前体水解酶(TACE)系列真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染的HeLa细胞系.方法 以THPl细胞eDNA为模板,PCR扩增人TACE基因的全长eDNA编码区序列,将其插入pMD18T载体中,构建出pMD18T-FL-TACE载体.在此基础上,应用重叠延伸PCR扩增出缺失解整合素区的TACE重组cDNA和缺失酶区的TACE重组cDNA,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体plRES2.0-EGFP中,同时TACE全长也构建入pIRES2.0-EGFP,这3种真核表达载体经酶切和测序鉴定后,用脂质体法转染HeLa细胞,经过G418筛选,获得稳定转染的HeLa细胞株,采用RT-PCR、Western blot及荧光法检测表达.结果 成功构建了pIRES2.0-EG-FP/FL-TACE、plRES2.0-EGFP/dis△-TACE、plRES2.0-EGFP/met△-TACE真核表达载体,并建立了稳定转染的HeLa细胞株,成功地表达了目的基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染HeLa细胞株的建立为进一步研究TACE功能奠定了必要的实验基础.
关键词： 人肿瘤坏死因子前体水解酶 解整合素 真核表达载体 重叠延伸PCR 转染 -
抗转铁蛋白受体单链抗体原核表达载体的构建和表达
目的构建抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体原核表达载体,为进一步研究其效应奠定基础.方法从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体pGEM-T-VHVH和pGEM-T-VL中扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,用重叠延伸PCR的方法,在VH和VL基因间引入连接短肽(Linker),构建VH-Linker-VL的单链抗体(single chain Fv,scFv)基因.经NcoⅠ和Not Ⅰ酶切后亚克隆到原核分泌型表达载体pUC19/119上,转化和筛选后,阳性细菌经IPTG诱导表达.间接免疫荧光法(IFA)及抗体封闭试验鉴定其抗体活性.结果凝胶电泳可见重叠延伸PCR扩增产物约700 bp条带,SDS-PAGE鉴定表达产物的分子量为27 kD左右,与scFv的理论值一致,IFA及抗体封闭试验证明表达产物有抗人TfR的活性.结论本研究成功地构建并表达了抗人TfRscFv,为抗人TfR scFv的应用奠定了基础.
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IPS-1基因缺失突变体真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建干扰素β启动刺激因子1(IPS-1)的300～444位氨基酸缺失突变体重组质粒,并初步鉴定.方法 通过重叠延伸PCR法获得缺失300～444位氨基酸的突变体△IPS-1,构建缺失突变体重组质粒pEF-BOS-FLAG-△IPS-1,并经XbaⅠ及claⅠ双酶切及测序鉴定.结果 双酶切缺失突变体重组质粒pEF-BOS-FLAG-△IPS-1后,琼脂糖凝胶电泳可见1 250 bp附近的片段.DNA测序结果做BLAST分析,显示重组质粒含有1 266 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了缺失300～444位氨基酸的IPS-1基因重组真核表达载体pEF-BOS-FLAG-△IPS-1.
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人端粒酶RNA突变体酵母三杂交诱饵质粒的构建
目的 对人端粒酶RNA进行多位点的突变并构建该突变体的酵母三杂交诱饵质粒,且进行毒性检测.方法 根据人端粒酶RNA(hTR)序列及突,变位点设计引物,运用重叠延伸PCR法埘hTR基因的第41位、第80位及第102位碱基进行T→A突变,将突变后的片段克隆入PMD18T载体.经测序正确后再亚克隆到酵母三杂交诱饵质粒PRH3′中,PCR及酶切鉴定.鉴定成功的重组诱饵质粒转化到酵母细胞L40ura3/pHyblex/ZeoMS2进行毒性检测.结果 经过测序验证,该基因预期位点突变成功且其他序列未发生随机突变,重组诱饵质粒构建成功,转化酵母菌之后对宿主无毒性.结论 成功构建了hTR突变体的重组质粒PRH3′-hTRm,可作为酵母三杂交系统中的"诱饵".
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GPC-3 CTL表位表达载体构建
将重组的乙肝表面抗原(pcHBsAg)中多个CTL表位,用外源性的磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位序列替换,构建单拷贝和多拷贝DNA疫苗,获得不同位点的单拷贝或可同时表达多个CTL表位肽的真核表达质粒.以pcHBsAg质粒为模板,应用重叠延伸PCR扩增出含三个不同位点磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位EYILSLEEL(EYI)的HBsAg基因片段EYI1,及替换pcHBsAg中不同CTL表位的HBsAg基因片段EYI2、EYI3;分别将EYI1、EYI2、EYI3基因片段插入pBSSK+载体中,构建出含3拷贝EYI的pBSSK/EYI1、pBSSK/EYI2、pBSSK/EYI3载体.在此基础上,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体pcDNA3.1+,构建表达EYI表位肽的DNA疫苗.真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,结果显示:成功构建了pcDNA.EYI1/HBsAg、pcDNA-EYI2/HBsAg、pcDNA-EYI3/HBsAg真核表达质粒,为进一步测定以GPC3基因为基础的HBsAg多肽候选疫苗提供理论、实验依据.
关键词： 表面抗原 表位替换 磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白 重叠延伸PCR -
BCR-ABL SH3双位点突变体构建及其促进KCL22细胞凋亡的研究
目的：BCR-ABL SH3结构域双位点突变体构建，探讨其促进CML细胞株凋亡机制，为CML治疗奠定基础。方法：采用重叠延伸PCR 扩增双突变体，构建含ABL SH3双突变基因的重组腺病毒载体，流式细胞术分析突变体对KCL22细胞凋亡的影响；同源建模构建ABL SH3双突变体；PepSite2．0软件预测双突变体相关蛋白结合能力。应用SPSS 16．0软件进行统计分析。结果：成功构建双突变体重组腺病毒载体，流式细胞术显示突变体较野生型显著促进 KCL22细胞凋亡；成功模拟并获得稳定的双突变体三维结构，筛选出的突变体与相关蛋白结合能力较野生型大大提高。结论：双突变体显著促进KCL22细胞凋亡，为ABL SH3结构研究及CML的治疗提供了理论基础。
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大肠杆菌偏嗜性Osteostat胞外段编码基因的克隆
目的 采用基因工程的手段研制人Osteostat胞外蛋白,通过大肠杆菌偏嗜性人Osteostat胞外段编码基因的克隆,为重组蛋白的研发作初步准备.方法 按照氨基酸密码子的简并性原则将人Osteostat胞外段编码系列全部替换成大肠杆菌偏嗜性密码子,并将其分成三段扩增,再通过重叠延伸PCR将三个片段连接起来.然后,将回收的人Osteostat基因片段和pQE-30Xa表达载体相连,转化大肠杆菌感受态细胞,进行初步的诱导表达,表达产物行SDS-PAGE分析.结果 通过重叠延伸PCR获得了大肠杆菌偏嗜性的编码序列,通过测序验证了其序列的正确性.对重组表达载体转化菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析证实获得预期分子量的目标蛋白.结论 大肠杆菌偏嗜性的人Osteostat胞外段编码基因表达载体的构建为重组蛋白的研发打下基础.
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重组小鼠白细胞介素-27融合蛋白多克隆抗体的制备及鉴定
目的:制备重组小鼠白细胞介素-27 (interleukin-27,IL-27)融合蛋白的多克隆抗体并鉴定其活性.方法:用反转录PCR从小鼠脾细胞扩增出EB病毒诱导基因3(EBI3)和p28成熟肽基因片段,采用重叠延伸PCR用(Gly4Ser)3接头将2个片段进行连接,将得到的小鼠IL-27单链融合基因片段克隆于pET-32a(+)载体.阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,利用SDS-PAGE与Western blot鉴定目的蛋白的表达.以纯化的IL-27融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗小鼠IL-27融合蛋白的多克隆抗体,利用Western blot和ELISA进行特异性及效价分析.结果:从小鼠脾细胞总RNA中扩增得到IL-27单链融合基因经测序与预期序列一致;在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,SDS-PAGE显示表达出的融合蛋白相对分子质量(molecular weight,Mr)约67 000;Western blot结果表明该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;该蛋白免疫新西兰大白兔后获得抗血清,Western blot结果显示该血清可以特异性地与IL-27融合蛋白结合,ELISA测定该多克隆抗体的效价可以达到1:3 200.结论:在大肠杆菌中成功表达出小鼠IL-27融合蛋白,并制备出效价较高、特异性较好的兔抗小鼠IL-27多克隆抗体.
关键词： 小鼠白细胞介素-27 重叠延伸PCR 融合蛋白 原核表达 多克隆抗体 -
利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换
目的 以磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(glypican-3,GPC3)的CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD,构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗.方法 以重组表面抗原基因pcHBsAg质粒为模板,应用重延伸PCR扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因HBsAg/GPC3,将其插入pBSSK+载体中,构建出pBSSK/GPC3载体.利用DNA重组技术将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,将真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,构建表达CTL表位EYILSLEEL的DNA疫苗.结果 酶切和测序的结果显示序列无错配,获得了完整表达EYILSLEEL表位的真核质粒pcDNA3-HBsAg/GPC3.结论 成功将EYILSLEEL表位替换HBsAg的内源性CTL表位,构建了pcDNA3-HBsAg/GPC3真核表达质粒.
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基于SOE-PCR的核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的构建及免疫效果研究
目的 构建pIRES2-MLAA34-HSP70重组质粒,并检测其免疫效果.方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)的方法提取急性单核细胞白血病相关抗原基因MLAA-34和热休克蛋白(HSP) 70基因,设计特异性重叠引物,以重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增MLAA34-HSP70融合基因,构建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70.将核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞对U937细胞的杀伤作用及小鼠脾细胞悬液中白细胞介素(IL)-2、IL-4和γ干扰素(IFN-γ)水平.结果 扩增出MLAA34-HSP70融合基因2 956 bp,成功构建了核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70,经鉴定与预期结果一致;脾淋巴细胞杀伤活性结果显示,核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70对U937细胞的杀伤效率明显高于其他实验组及对照组(P＜0.01);核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70组细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平亦明显高于其他实验组及对照组(P＜0.01).结论 成功构建了pIRES2-MLAA34-HSP70核酸疫苗,该核酸疫苗能诱发强烈的体液免疫,增强机体对肿瘤细胞的免疫应答,对MLAA34阳性细胞具有特异性杀伤作用.
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全人源抗人干扰素α1b基因工程抗体与抗原的结合表位鉴定
目的 鉴定抗原人干扰素α1b(huIFN-α1b)与1株全人源抗体蛋白AIFNa1IgG1的结合表位.方法 从正常人分离纯化淋巴细胞并抽提mRNA进行CDNA合成,以CDNA为模板通过PCR扩增得到huIFN-α1b基因,通过重叠延伸PCR法构建huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸残基缺失突变体及点突变体,野生型和突变基因与载体pET30a连接构建重组表达载体,将以上重组表达载体转化大肠杆菌表达宿主E.coli Rosseta(DE3),诱导表达后的huIFN-α1b蛋白及突变体通过Western blot分析其与全人源抗huIFN-α1b基因工程抗体蛋白的结合活性.结果 huIFN-α1b蛋白在E.coli Rosseta (DE3)细胞中成功表达,Western-blot分析表明野生型huIFN-α1b蛋白与抗体结合,29-35位氨基酸缺失与抗体失去结合活性,其中27位的Ser,33位的Asp,34位的Arg,35的His,36位的Asp突变为Gly后,抗体与huIFN-α1b的结合可减弱到不可检测的水平.结论 huIFN -α1b蛋白29-35位氨基酸形成的表位是与抗体AIFNa1IgG1结合的重要表位.
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具有不同酶活性并可抵抗特异shRNA降解的nm23-H1真核表达载体的构建和表达
背景与目的已有的研究证明nm23-H1基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因，但其抑制肿瘤转移的生化机理尚不完全清楚。Nm23-H1基因结构和功能异常与肿瘤的侵袭转移有密切关系。我们前期已构建了nm23-H1的短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）载体以及可抵抗此shRNA降解的nm23-H1的cDNA的表达载体，在此基础上我们欲应用基因定点突变技术构建具有不同酶活性并能抵抗此shRNA降解的nm23-H1cDNA真核表达载体，并通过恢复实验验证其表达，为进一步研究肿瘤抑制基因nm23-H1的分子机制提供理论基础和实验依据。方法以pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1质粒为突变模板，应用重叠延伸PCR方法引入nm23-H1基因四个单点突变和一个联合位点突变，并将突变基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1Hygro(+)。将突变质粒转染人肺腺癌细胞株A549/nm23-H1-shRNA（稳定沉默nm23-H1基因），利用Western blot技术验证不同突变体nm23-H1蛋白的表达。结果成功构建了shRNA抵抗的nm23-H1S44A、nm23-H1P96S、nm23-H1H118F、nm23-H1S120G、nm23-H1P96S-S120G五个突变型真核表达载体，经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致，经Western blot验证nm23-H1蛋白表达正常。结论成功构建了五个具有不同突变位点的shRNA抵抗的nm23-H1基因真核表达载体，并且突变蛋白质nm23-H1表达正常，同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。
关键词： nm23-H1 重叠延伸PCR 定点突变 Western blot -
用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原基因中的突变
目的:利用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因中的突变碱基.方法:针对构建的重组质粒PGEM-7Z/HBcAg中的两处突变设计三对引物,PCR定点突变后对重新构建的PGEM-7Z/HBcAg进行菌落PCR和酶切鉴定,初步筛选的阳性克隆进一步通过序列分析进行确证.结果:经PCR定点突变后,测序证明HBcAg基因序列与设计完全一致.结论:用该方法成功纠正了人工合成的乙肝病毒核心抗原基因中两个碱基的缺失,获得了预期的目的基因.
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小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用
目的 构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达栽体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性.方法 利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3.将该融合基因插入真核表达栽体pcDNA3.1(+)获得重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后.用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用.结果 经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性.结论 本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础.
