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人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定
目的 克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体基因,获得全抗体蛋白.方法 利用PCR技术以gⅢ-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链；经Nco Ⅰ/XhoⅠ和Sac Ⅰ/Hind Ⅲ 分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达.采用免疫荧光(IFA)和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定.采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定.结果 成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因；免疫荧光(IFA)鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与hulFN-α1b特异性结合；经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5～20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合.结论 通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b(huIFN-α1b)全抗体蛋白.
关键词： 杆状病毒/昆虫表达系统 人干扰素α1b IgG全抗体 表达 纯化 -
全人源抗人干扰素α1b基因工程抗体与抗原的结合表位鉴定
目的 鉴定抗原人干扰素α1b(huIFN-α1b)与1株全人源抗体蛋白AIFNa1IgG1的结合表位.方法 从正常人分离纯化淋巴细胞并抽提mRNA进行CDNA合成,以CDNA为模板通过PCR扩增得到huIFN-α1b基因,通过重叠延伸PCR法构建huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸残基缺失突变体及点突变体,野生型和突变基因与载体pET30a连接构建重组表达载体,将以上重组表达载体转化大肠杆菌表达宿主E.coli Rosseta(DE3),诱导表达后的huIFN-α1b蛋白及突变体通过Western blot分析其与全人源抗huIFN-α1b基因工程抗体蛋白的结合活性.结果 huIFN-α1b蛋白在E.coli Rosseta (DE3)细胞中成功表达,Western-blot分析表明野生型huIFN-α1b蛋白与抗体结合,29-35位氨基酸缺失与抗体失去结合活性,其中27位的Ser,33位的Asp,34位的Arg,35的His,36位的Asp突变为Gly后,抗体与huIFN-α1b的结合可减弱到不可检测的水平.结论 huIFN -α1b蛋白29-35位氨基酸形成的表位是与抗体AIFNa1IgG1结合的重要表位.
