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吲哚美辛显著增强伊马替尼对KCL22和K562/G01细胞的增殖抑制作用
目的:研究吲哚美辛联合伊马替尼对KCL22和K562/G01细胞增殖的抑制作用,并从Wnt/β-Catenin信号通路角度探讨其抗增殖作用的分子机制.方法:采用MTT法明确吲哚美辛在各细胞中的佳作用浓度及时间;采用MTT法和甲基纤维素集落形成实验检测伊马替尼、吲哚美辛以及两者联合对各细胞增殖能力的影响;采用流式细胞术鉴定细胞周期及细胞凋亡的变化;Western blot检测经两种药物处理的细胞内pβ-catenin(S33/37/T41)、pGSK-3β(Ser9)和C-MYC蛋白的表达情况.结果:吲哚美辛抑制细胞增殖的佳作用浓度和时间分别为80μmol/L和48 h;吲哚美辛联合伊马替尼对细胞的增殖抑制作用明显优于单一药物处理;在KCL22和K562/G01细胞株中联合用药组的细胞周期均被阻制在G0/G1期;联合用药组的细胞凋亡数目明显高于单一药物处理组;与对照组或单一药物处理组相比,联合用药组细胞内pβ-catenin、β-catenin、pGSK-3β (Ser9)和C-MYC蛋白表达明显下调.结论:吲哚美辛可显著增强伊马替尼对KCL22和K562/G01细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡,并通过抑制Wnt/β-Catenin信号通路调控细胞的增殖.
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ABL SH3-T79Y突变体联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞增殖的影响
目的 分析慢性粒细胞白血病(CML) BCR-ABL蛋白的SH3结构域突变体(ABL SH3-T79Y)联合伊马替尼(IM)在体内外对CML细胞增殖的影响,并初步探讨其发挥作用的机制.方法 构建重组腺病毒载体SH3-T79Y突变体,将其联合IM处理K562/G01细胞后,采用克隆形成实验检测细胞克隆形成率,流式细胞术检测细胞周期,分析K562/G01细胞体外增殖能力的变化.SH3-T79Y联合IM处理KCL22细胞,构建BALB/c裸鼠皮下实体瘤模型,计算皮下瘤形成率,摘取瘤体进行病理学检查,分析KCL22细胞体内增殖能力的变化.SH3-T79Y联合IM处理K562/G01细胞后,采用Western blotting检测p-BCR-ABL、BCR-ABL、p-CrkL、CrkL、Cyclin Dl蛋白的表达水平,分析联合作用影响CML细胞增殖的机制.实验中以PBS、腺病毒空载体及IM单独处理细胞作为对照.结果 相较于三个对照组,SH3-T79Y联合IM处理K562/G01细胞后,细胞克隆形成率(28.74％±6.64％)明显降低(P＜0.05),细胞周期阻滞于S期.联合处理KCL22细胞后,KCL22-BALB/c裸鼠皮下实体瘤模型成瘤率为16.7％,明显低于IM单独处理组(33.3％)和PBS对照组(100％),瘤体病理学检查见大量增殖的瘤细胞;Western blotting检测结果显示联合处理后K562/G01细胞p-BCR-ABL、p-CrkL、BCR-ABL、CrkL及Cyclin D1的表达均降低.结论 SH3-T79Y联合IM通过抑制BCR-ABL、CrkL磷酸化和降低Cyclin D1表达,在体内、体外发挥了抑制CML细胞增殖的效应.
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BCR-ABL SH3双位点突变体构建及其促进KCL22细胞凋亡的研究
目的：BCR-ABL SH3结构域双位点突变体构建，探讨其促进CML细胞株凋亡机制，为CML治疗奠定基础。方法：采用重叠延伸PCR 扩增双突变体，构建含ABL SH3双突变基因的重组腺病毒载体，流式细胞术分析突变体对KCL22细胞凋亡的影响；同源建模构建ABL SH3双突变体；PepSite2．0软件预测双突变体相关蛋白结合能力。应用SPSS 16．0软件进行统计分析。结果：成功构建双突变体重组腺病毒载体，流式细胞术显示突变体较野生型显著促进 KCL22细胞凋亡；成功模拟并获得稳定的双突变体三维结构，筛选出的突变体与相关蛋白结合能力较野生型大大提高。结论：双突变体显著促进KCL22细胞凋亡，为ABL SH3结构研究及CML的治疗提供了理论基础。
