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柔红霉素对KG1a细胞增殖及肿瘤相关抗原Eps8表达的影响
本研究旨在观察柔红霉素(DNR)对KG1a细胞株的杀伤抑制作用及新型肿瘤相关抗原表皮生长因子受体通路底物8(Eps8)在KG1a细胞中的表达,在mRNA和蛋白水平探讨DNR作用于KG1a后对Eps8表达的影响.不同浓度DNR作用于KG1a细胞24、48和72 h,用台盼蓝拒染色法检测药物对KG1a细胞的杀伤抑制率,用实时荧光定量PCR法检测Eps8 mRNA转录水平的变化和Western blot法观察Eps8蛋白表达变化.结果表明:随着药物浓度(0.1,0.4 μg/ml)的增加及作用时间(24,46,72 h)的延长,DNR对KG1a细胞的杀伤抑制率显著提高(r=0.983,P＜0.01)；不同DNR药物浓度作用于KGla 24、48和72 h后,Eps8表达水平以DNR作用浓度和时间依赖方式明显下降(r=0.979,P＜0.05).结论:随药物浓度的增加和作用时间的延长,DNR对KG1a细胞的杀伤抑制率提高,使Eps8表达下降,推测降低Eps8的表达可能是DNR抑制KG1a细胞增殖的机制之一.
关键词： 表皮生长因子受体通路底物8 KG1a细胞 柔红霉素 -
表皮生长因子受体通路底物8疫苗对乳腺癌细胞的抑制效应及其可能机制
目的:探索表皮生长因子受体通路底物8(epidermal growth factor receptor substrate 8,EPS8)疫苗对乳腺癌细胞的抑制效应及其可能的机制.方法:Western blotting检测EPS8蛋白在小鼠乳腺癌4T1细胞株中的表达.通过基因重组、表达和纯化等技术制备特异性的小鼠源性EPS8,以EPS8蛋白为靶点制备抗肿瘤疫苗并免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定免疫前后不同时间小鼠血清内抗EPS8抗体效价;流式细胞术检测免疫前后的脾T淋巴细胞亚群比例.建立乳腺癌4T1细胞荷瘤小鼠模型并接种EPS8疫苗,接种佐剂作为对照,比较2组荷瘤小鼠的生存期、肿瘤体积、肿瘤重量,计算EPS8疫苗抑瘤率;流式细胞术检测荷瘤小鼠脾T淋巴细胞亚群比例,LDH法检测其细胞毒性T细胞(CTL)杀伤率.结果:EPS8蛋白在乳腺癌4T1细胞株中高表达.成功构建的EPS8蛋白疫苗免疫小鼠后产生抗EPS8抗体,且随着免疫次数的增加,小鼠体内抗EPS8抗体滴度呈上升趋势.乳腺癌4T1细胞接种于经EPS8疫苗或佐剂免疫后的小鼠后,与佐剂对照组相比,EPS8疫苗组小鼠生存期显著升高[中位生存时间:44(38～50) vs 37 (34～40)d;t=2.477,P=0.043],肿瘤质量显著降低[(2.21±0.35)vs(3.31±0.88)g;t=3.574,P=0.009],EPS8疫苗的抑瘤率为33.23％.EPS8疫苗组小鼠脾CD4+T比例和CD4 +/CD8+比值均显著高于佐剂对照组(P＜0.001),EPS8疫苗组CD4+ CD25+ Treg/CD4+T细胞的比值显著低于佐剂对照组(P＜0.001).效靶比为20:1时,EPS8疫苗组CTL对靶细胞的杀伤活性即显著高于佐剂对照组[(19.05±4.41)％ vs (13.36±3.10)％;t=2.263,P=0.040].结论:EPS8疫苗不仅具有诱导小鼠产生体液免疫应答的功能,还能够降低荷瘤小鼠体内Treg细胞比例,激活机体内T细胞免疫功能;EPS8疫苗可抑制肿瘤的生长、有效延长荷瘤小鼠的生存期.
关键词： 肿瘤疫苗 表皮生长因子受体通路底物8 乳腺癌 4T1细胞 -
Eps8抗原改造表位 HLA-A*0201限制性抗肿瘤能力观察
目的：观察人表皮生长因子受体通路底物8（Eps8）抗原改造表位是否有人白细胞抗原A（HLA-A）*0201限制性抗肿瘤能力。方法替换 Eps8抗原锚定位点氨基酸获得改造肽，用 BIMAS、SYFPEITHI 在线数据库及 Aotodock 4．2软件预测改造表位与 HLA-A*0201分子的结合力，筛选出稳定结合的改造表位 E1-9V（ILDDIEF-FV）、E1-1Y9V（YLDDIEFFV）。用经典肽结合力实验检测各改造表位与 HLA-A*0201分子的亲和力。制备天然表位（E1）、E1-9V、E1-1Y9V 特异性杀伤性 T 淋巴细胞（CTLs）。用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测并比较 E1-9V、E1-1Y9V 特异性 CTLs 对 MCF-7细胞、沉默 Eps8的 MCF-7细胞（MCF-7／shRNA）和抗 HLA-A2抗体预孵育的 MCF-7细胞（MCF-7／A2Ab）的杀伤率，E1-9V、E1-1Y9V 特异性 CTLs 对 SW480、U251、K562、IM-9细胞的杀伤率，E1、E1-9V、E1-1Y9V 特异性 CTLs 对 T2细胞的杀伤率。结果 E1-9V、E1-1Y9V 均可与 HLA-A*0201分子 B、F 对接口袋的氨基酸形成稳定氢键。肽结合力实验结果显示 E1-9V、E1-1Y9V 与 HLA-A*0201均具有高亲和力，且高于天然表位 E1，P 均＜0．05。E1-9V、E1-1Y9V 特异性 CTLs 对 MCF-7／shRNA、MCF-7／A2Ab 细胞杀伤率明显低于 MCF-7细胞，P 均＜0．05。E1-9V、E1-1Y9V 特异性 CTLs 对 SW480、U251细胞杀伤率明显高于 K562、IM-9细胞（P 均＜0．05）。E1-1Y9V 特异性 CTLs 对 T2细胞的杀伤率显著高于 E1、E1-9V 特异性 CTLs，P 均＜0．05。结论 Eps8抗原改造表位 E1-9V、E1-1Y9V 与天然表位 E1相比具有更高的 HLA-A*0201分子亲和力，保留了原有的免疫原性，并且 E1-1Y9V 抗肿瘤免疫效应强于天然表位 E1。
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血管生成素1对大鼠血-脊髓屏障功能的增强作用
目的:探讨血管生成素1 (Ang1)对大鼠血-脊髓屏障功能的增强作用,及表皮生长因子受体通路底物8(Eps8)在此增强过程的作用.方法:分离、培养大鼠脊髓微血管内皮细胞(SCMEC),建立体外血-脊髓屏障模型.以Ang 1处理的SCMEC为Ang1处理组,未处理的为对照组.于Ang1处理后于不同时间点(0h、4h、8h、12h)测定各组跨内皮电阻(TEER)值,比较2组Eps8蛋白的表达水平.再将SCMEC分为对照siR-NA组、对照siRNA+Ang1组、Eps8 siRNA组及Eps8 siRNA+Angl组,分别给予siRNA干扰Eps8表达及Ang 1处理,比较不同组间Eps8蛋白的表达水平与TEER值.结果:Ang1处理组4h、8h、12 h SCMEC的TEER值均明显高于对照组(P＜0.05),Eps8蛋白的表达水平均高于对照组(P＜0.05).Eps8 siRNA组SCMEC中Eps8蛋白的表达水平明显低于对照siRNA组(P＜0.05),而与Eps8 siRNA+Ang1组间差异无统计学意义(P＞0.05);Eps8 siRNA组不同时间点TEER值均明显低于对照siRNA组(P＜ 0.05);Eps8 siRNA+Ang1组与Eps8 siRNA组间TEER值差异无统计学意义(P＞0.05).结论:Ang1可增强大鼠血-脊髓屏障的功能,其机制可能与Eps8有关.
关键词： 表皮生长因子受体通路底物8 血管生成素1 血-脊髓屏障功能 大鼠 -
顺铂作用下卵巢癌细胞株CP70中Eps8表达变化研究
目的：观察肿瘤相关抗原Eps8在卵巢癌细胞株A2780、CP70、SKOV3、SKOV3／DDP中的表达情况，筛查出Eps8高表达细胞株CP70。观察顺铂（DDP）作用下CP70细胞中Eps8在蛋白水平表达的变化，探讨Eps8在卵巢癌化疗耐药中的作用。方法：用实时荧光定量PCR法检测Eps8在卵巢癌细胞株中mRNA的表达水平，用Westernblot法检测Eps8蛋白表达水平，筛选出高表达株CP70。用不同浓度DDP作用于CP70细胞24h、48h，用Westernblot法检测Eps8在蛋白水平的变化。结果：随着药物浓度的增加及作用时间的延长，Eps8在蛋白水平的表达明显升高。结论：顺铂处理CP70细胞后，Eps8的蛋白表达量升高，且和DDP作用的时间及剂量有依赖性，即DDP可诱导CP70细胞中Eps8表达的上调。因此推测，Eps8在卵巢癌顺铂耐药形成机制中发挥重要作用。
