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我国TGFBI基因相关性角膜营养不良的研究现状
TGFBI是常见的角膜营养不良致病基因,角膜营养不良家系在TGFBI基因上的突变已发现33种,TGFBI基因表达的产物角膜上皮蛋白(keratoepithelin,KE蛋白)沉积于患者角膜中.1998-2014年中国人角膜营养不良TGFBI基因突变类型已报告17种,约71个家系445例患者,其中由R555W突变导致的Ⅰ型颗粒状角膜营养不良占28.2％,由R124H突变导致的Ⅱ型颗粒状角膜营养不良占23.9％,而Thiel-Behnke角膜营养不良家系在中国人较少见(5％).
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中国角膜营养不良四个家系的TGFBI基因突变谱分析
目的 分析Reis-Bücklers角膜营养不良(RBCD)、Avellino角膜营养不良(ACD)、格子状角膜营养不良Ⅰ型(LCD Ⅰ)和格子状角膜营养不良Ⅰ/ⅢA型(LCD Ⅰ/ⅢA)4个中国家系转化生长因子β诱导(TGFBI)基因的突变情况,进一步探讨角膜营养不良表型和基因型之间的关系.方法 2010年2月至2012年10月期间采集4个家系中共22例患者、22名表型正常成员和100名健康对照的外周血.提取基因组DNA,合成TGFBI基因所有外显子的特异性引物,应用聚合酶链反应(PCR)进行扩增,并对PCR产物进行直接测序分析.结果 RBCD家系14例患者TGFBI基因第4外显子均显示c.371G ＞T (R124L)杂合突变,家系中表型正常成员未检测到此突变;ACD家系中1例患者TGFBI基因第4外显子显示c.371G＞A(R124H)杂合突变,家系表型正常成员的遗传学资料缺如;LCD Ⅰ家系3例患者TGFBI基因第4外显子均显示c.370C＞ T(R124C)杂合突变,家系表型正常成员未检测到此突变;LCD Ⅰ/ⅢA型家系中4例患者TGFBI基因第14外显子均显示c.1877A＞G (H626R)杂合突变,家系表型正常成员的遗传学资料缺如.100名健康对照未发现TGFBI基因突变.结论 TGFBI角膜营养不良表型和基因型之间存在高度相关性,R124是TGFBI基因的突变热点.
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颗粒状角膜营养不良的研究进展
颗粒状角膜营养不良是一种临床少见的常染色体显性遗传病,由于5q31染色体上的TGFBI突变使TGFBIp在角膜前弹力层和基质层异常聚集以及代谢的障碍,导致患者双侧角膜进行性出现不同程度的的浑浊,造成视力的进行性损害.目前报道的TGFBI突变至少有66种,其中至少有10种与颗粒状角膜营养不良有关,由于基因型的差异、纯合子以及杂合子的区别,患者表现型也有很大的差别.随着人们对该病认识的提高,共聚焦显微镜、基因诊疗等方法的应用,越来越多的患者得到了正确诊断,目前的治疗的方法主要有角膜移植和激光消融治疗,但由于术后复发甚至加重的原因,并不能使患者满意.由于颗粒状角膜营养不良动物模型的建立,锂或者基因治疗等方法将会有良好的应用前景.
关键词： 颗粒状角膜营养不良(GCD) TGFBI TGFBIp 动物模型 -
结肠癌实质细胞长标签基因表达系列分析文库的建立及应用
目的:应用长标签基因表达系列分析(long serial analysis of gene expression,LongSAGE)技术定量分析结肠癌实质细胞转录组,并筛选肿瘤相关基因.方法:应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)、RNA提取和线性扩增方法得到结肠癌实质细胞及其相应正常结肠上皮细胞的反义RNA(antisense RNA,aRNA)样品,构建LongSAGE文库;然后应用SAGE2000软件对所得序列文本进行分析,筛选肿瘤相关基因;后采用RT-PCR方法验证该差异表达基因.结果: 结肠癌细胞LongSAGE文库标签体总数为50 542个,识别出基因总数为16 497个.正常结肠细胞LongSAGE文库标签体总数为50 124个,识别出基因总数为16 417个.LongSAGE文库筛选出结肠癌差异表达基因705个(P＜0.05).转化生长因子β诱导基因(transforming growth factor β-induced gene,TGFBI)为LongSAGE文库筛选出的结肠癌相关基因,RT-PCR检测验证了其在结肠癌组织标本中表达上调.结论:LCM-LongSAGE是对结肠癌实质细胞进行定量转录组研究的可行流程.
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CRISPR/Cas9构建TGFBI稳定敲除HSC-3细胞系
目的 利用CRISPR/Cas9技术稳定敲除人口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞系HSC-3中的TGFBI基因.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对于TGFBI外显子3上下游的小向导RNA(small guide RNA, sgRNA),并以PX330质粒为骨架构建能表达此sgRNA的真核重组质粒.将此质粒以及PGK-puro质粒共转染HSC-3细胞,用嘌呤霉素抗性筛选细胞克隆,并用PCR、核酸电泳和测序初步确定基因敲除情况,再通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法确认细胞中TGFBI的mRNA和蛋白水平的表达变化情况.结果 通过CRISPR/Cas9技术,HSC-3中的TGFBI基因外显子3的核苷酸序列已被完全敲除.免疫印迹法检测显示,相对于HSC-3,TGFBI敲除细胞中无法检测到TGFBI蛋白的表达.同时,通过RT-qPCR对部分基因进行检测,发现一系列与细胞周期和上皮间充质转化相关基因表达发生了改变(P<0.05).结论 通过CRISPR/Cas9技术成功获得了TGFBI基因敲除的HSC-3细胞系,为进一步研究TGFBI在OSCC中的作用及其机制提供了理论基础.
关键词： CRISPR/Cas9 TGFBI HSC-3细胞 基因敲除 -
A546D突变型TGFBI基因真核表达载体的构建及体外表达
目的 构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体和体外转染体系,为研究野生型及A546D突变型TGFBI基因的功能提供实验基础.方法 应用重叠延伸PCR法定点诱变,构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人角膜上皮(human corneal epithelium,HCE)细胞,Western Blot法检测转染后培养基中HCE细胞分泌的TGFBI蛋白的表达.结果 重组质粒总长约7.5 kb,由HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切鉴定产生5.4 kb和2.1 kb两条片段者为克隆正确质粒.测序鉴定证实了TGFBI基因编码区完整插入到载体pcDNA3.1的多克隆位点中,突变载体的第1685位碱基由C替换为A,使其编码的第546个氨基酸由Ala突变为Asp即A546D突变.野生型及A546D突变型载体转粢入HCE细胞后,TGFBI蛋白有效表达.结论 成功构建了A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,为TGFBI基因相关性角膜营养不良致病机制的研究奠定了基础.
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小鼠TGFBI基因真核表达载体的构建和表达
目的 构建小鼠TGFBI基因的真核表达载体,为研究角膜营养不良的发病机制奠定基础.方法 提取BALB/cBy小鼠正常角膜组织总RNA,经反转录-PCR合成TGFBI cDNA,克隆入真核表达载体pcDNA3.1并测序验证.用不同剂量重组质粒pcDNA3.1-TGFBI转染NIH3T3细胞,通过SYBR荧光实时定量PCR和Western blot检测TGFBI在细胞中的表达.结果 测序结果 显示扩增到的TGFBI cDNA以正确序列和方式插入载体,实时定量PCR和Western blot结果 显示TGFBI在NIH3T3细胞中表达增强.结论 成功构建了小鼠TGFBI基因真核表达载体,并在细胞中进行表达,为进一步研究TGFBI在角膜内的生理、病理功能奠定基础.
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卵巢上皮性癌组织中TGFBI基因启动子甲基化及VEGF检测
目的:检测卵巢上皮性癌组织中TGFBI基因启动子的甲基化状态及VEGF的表达,探讨二者的关系.方法:应用甲基化特异性PCR法(MSP)和免疫组化SP法分别检测20例正常卵巢组织、20例卵巢良性上皮性肿瘤组织及30例卵巢上皮性癌组织中TGFBI基因启动子的甲基化状态及VEGF蛋白的表达.结果:3种组织中TGFBI基因启动子的甲基化率及VEGF蛋白的阳性表达率差异均有统计学意义(χ2=34.886和26.298,P<0.001),卵巢上皮性癌组织中TGFBI基因的甲基化率及VEGF蛋白的阳性表达率均高于正常卵巢组织和卵巢良性上皮性肿瘤组织.卵巢上皮性癌组织中TGFBI基因启动子甲基化与VEGF的表达有关联(χ2=13.976,rP=0.516,P<0.001).结论:TGFBI基因启动子在卵巢上皮性癌组织中发生超甲基化,可能诱导血管生成,促进卵巢上皮性癌的发生发展.
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转化生长因子β诱导的基因抑制恶性间皮瘤细胞增殖的体外研究
目的 研究转化生长因子β诱导的基因(transforming growth factor-β induced gene,TGFBI)在体外是否能抑制恶性间皮瘤细胞NCI-H28的增殖.方法 将外源性TGFBI稳定性转染到恶性间皮瘤细胞NCI-H28中,绘制生长曲线图,测定其细胞增殖、接种效率和软琼脂克隆形成,并进行细胞周期的分析.结果 外源性TGFBI在恶性间皮瘤细胞NCI-H28中能够稳定地高表达;当外源性的TGFBI转入到肿瘤细胞NCI-H28后,TGFBI高表达的细胞倍增时间增加了4.38倍;与转染空载体的肿瘤细胞相比:NCI-H28的相对接种效率降低了69.68％,外源性TGFBI表达的T28细胞形成了较小的软琼脂克隆;TGFBI可以使肿瘤细胞阻滞在G1期,并延缓肿瘤细胞进入S期的时间.结论 TGFBI可以抑制恶性间皮瘤细胞的体外增殖.
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视网膜格子样变性并颗粒状角膜营养不良一家系临床观察和基因突变检测
目的 观察一个视网膜格子样变性并颗粒状角膜营养不良(GCD)2型家系的临床表现和基因突变位点.方法 1个视网膜格子样变性并GCD 2型家系三代10名成员纳入研究.其中,患者6例、健康成员4名.患者中男、女各3例;均为双眼.所有受试者均行视力、裂隙灯显微镜、三面镜、眼底彩色照相、光相干断层扫描、角膜内皮计数检查.采集所有受试者以及与其共同生活、无相关遗传性疾病的配偶外周静脉血2 ml,提取基因组DNA,二代测序法检测转化生长因子β诱导(TGFBI)基因突变位点;并对受试者以及配偶进行Sanger验证.结果 6例患者12只眼中,视力数指/20 cm～1.0.角膜中央可见浅基质层雪花样混浊3例6只眼;少量点状浅基质层颗粒样混浊3例6只眼.角膜内皮细胞计数均正常.视网膜格子样变性3例6只眼,其中孔源性视网膜脱离3例4只眼;视网膜轻度变薄、未见明显格子样变性2例4只眼.眼球旋转震颤、眼底检查未见明显异常1例2只眼.基因检测结果显示,先证者和4例患者的TGFBI基因第4外显子均存在c.371G>A错义突变,该突变位点所对应的氨基酸改变为TGFBI基因所编码蛋白的第124号氨基酸由精氨酸变异为组氨酸(p.R124H).携带该位点的患者均有不同程度临床表型.结论 TGFBI基因突变位点c.371G>A(p.R124H)是该家系GCD的致病基因;携带该位点的患者均有不同临床表型.
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Avellino型角膜营养不良的研究进展
Avellino型角膜营养不良(Avellino corneal dystrophy,ACD)是一种常染色体显性眼异常疾病,其病因是位于第5号人类染色体上的转化生长因子β诱导基因(transforming growth factor-beta induced gene,TGFBI)存在R124H突变终导致异常TGFBI蛋白沉积于角膜组织,而由突变导致异常蛋白质沉积的潜在分子机制目前尚不清楚.近年来,随着人类遗传学、眼病的分子生物学的快速发展和研究技术的不断提高,人们对Avellino型角膜营养不良的发病基础和可能的发病机制有了更多的认识,而尝试组织该疾病发病机制方面的有关研究成果,理解TGFBI和与之相互作用蛋白Periostin在该疾病中所扮演的作用将有助于后续的相关研究.
关键词： TGFBI Periostin Avellino型角膜营养不良 基因 相互作用 -
人TGFBI基因克隆及真核表达载体的构建
目的:克隆人TGFBI基因,并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从供体角膜移植术后留下的角膜组织中克隆人TGFBI基因全长编码区,将该DNA片断亚克隆到克隆载体pMD18-T中,进一步通过和SalI双酶切将目的片断定向克隆至真核表达质粒载pCI中.经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒.结果:获得了人TGFBI的编码基因,并成功建了其真核表达载体.结论:人TGFBI基真核表达质粒的成功构建并鉴定.
