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EV71中和表位嵌合病毒样颗粒的表达纯化
目的 通过原核系统表达纯化嵌合肠道病毒71型(EV71)中和表位SP70的病毒样颗粒(VLPs),作为备选的EV71基因重组亚单位疫苗.方法 将SP70插入乙肝病毒核心抗原(HBcAg)截短序列的主要免疫显性区域,合成融合蛋白基因后连接表达质粒转化入大肠埃希菌诱导表达,经DEAE离子交换层析、CsCl垫层离心以及密度梯度离心后得到纯化的重组VLPs,并通过Western Blot和ELISA实验鉴定其抗原性.结果 成功构建重组质粒pHBc-SP70,在大肠埃希菌中经IPTG低温诱导后高效表达,可溶性目的蛋白经离子交换层析、CsCl垫层离心和密度梯度离心三步纯化后纯度可达90％以上;纯化的融合蛋白可自发折叠组装为病毒样空心颗粒,与抗SP70单克隆抗体和抗HBc单克隆抗体均可特异性结合.结论 在原核系统中成功高效表达和纯化了表面展示EV71中和表位的嵌合HBc-SP70 VLPs,并证实其具有良好的抗原性,为该EV71基因重组疫苗的免疫效果评价奠定了基础.
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肝组织中Fas/FasL的表达与慢性乙型肝炎的关系
目的:探讨肝组织中Fas/FasL表达与慢性乙型肝炎的关系.方法:30例慢性乙型肝炎患者肝穿刺肝组织病理检查及免疫组化SP法检测肝组织中的Fas/FasL、HbcAg.结果:肝组织中Fas、FasL表达强度与HBcAg在肝组织表达呈正相关(P＜0.001),与慢性肝炎病理损伤的程度即炎症活动度呈正相关(P＜0.001),与肝纤维化程度呈正相关(P＜0.0 01). 结论:HBV持续感染及复制可诱导肝细胞表达Fas/FasL,其表达程度随着慢性肝炎病理损伤的程度即炎症活动度及肝纤维化程度加重而增强.Fas-FasL系统介导的细胞凋亡,确实参与了慢性乙型肝炎的发病机制,且在慢性乙型肝炎的发生发展中起重要作用.
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重组乙肝病毒核心基因DNA与表面抗原-抗体共免疫应答研究
目的:了解小鼠对乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因免疫及与乙肝表面抗原-抗体复合物(HBsAg-抗HBs)联合免疫的应答.方法:用表达乙肝病毒核心抗原N端144个氨基酸的重组质粒DNA(简称pHBc144)100μg及含1μgHBsAg的重组乙肝表面抗原-鼠抗体组建的复合物(简称sIC)免疫Balb/c小鼠.用EHSA法检测血清抗体IgG和IgG1、IgG2a亚类的效价.用半定量PCR法分别检测鼠脾细胞IFN-γ及IL-4的mRNA.结果:pHBc144及sIC联合免疫鼠的抗HBs IgG、IgG1、IgG2a效价均显著高于sIC组(P＜0.05).同时小鼠还可产生抗HBc及由HBsAg、HBcAg特异诱生的IFN-γ及IL-4.但与sIC共免疫,小鼠对HBcAg诱生的IFN-γ mRNA有所降低.结论:可用HBcAg基因与sIC共免疫,以获得针对乙肝病毒2种结构蛋白的免疫应答.
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乙肝病毒核心抗原DNA疫苗诱导小鼠抗原特异性CD8+T细胞动态变化和动态分布
目的:研究乙肝病毒核心抗原(HBcAg)DNA疫苗诱导的细胞免疫应答.方法:用表达乙肝病毒核心抗原N端144个氨基酸的重组质粒DNA(简称pHBc144)100 μg免疫C57BL/6小鼠,用细胞内细胞因子染色技术检测小鼠体内抗原特异性CD8+T细胞的动态变化.结果:pHBc144免疫后抗原特异性CD8+T细胞逐渐增多,在初次免疫的第14天出现第一个免疫应答高峰,此后抗原特异性CD8+T细胞数量逐渐下降进入免疫记忆期并在1年内维持在稳定水平.加强免疫后在第10天抗原特异性CD8+T细胞数量达到高峰,约是初次免疫应答高峰的2倍,此后抗原特异性CD8+T细胞数量逐渐下降,但下降的速度比初次免疫应答减缓.结论:pHBc144DNA疫苗可诱导有效的细胞免疫应答.
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人乳头瘤病毒L2蛋白的病毒样颗粒疫苗研究
目的：构建乙肝病毒核心抗原（ HBcAg）与人乳头瘤病毒（ HPV） L2抗原的融合蛋白，在大肠杆菌中重组表达形成病毒样颗粒结构；通过小鼠模型检测HBc－L2融合蛋白的免疫原性，并研究免疫后获得的小鼠血清对HPV假病毒的中和效力。方法：通过DNA合成构建16型人乳头瘤病毒L2基因片段与HBcAg基因的融合基因，将其克隆至表达载体pET9a并在大肠杆菌中进行HBc－L2融合蛋白表达；将经纯化、鉴定后的融合蛋白免疫BALB／c小鼠，用间接ELISA方法检测小鼠血清中针对L2抗原的抗体效价，并分别研究小鼠血清对16型和18型HPV假病毒的中和效力。结果：HBc－L2融合基因经大肠杆菌系统表达形成可溶性蛋白，经硫酸铵沉淀和CL－4 B凝胶分离纯化后获得纯度＞80％的HBc－L2蛋白；分子筛高效液相色谱－多角度激光光散射（ SEC－MALS）联用技术和透射电子显微镜的分析结果表明，HBc－L2融合蛋白在表达过程中自动组装形成稳定的病毒样颗粒；将纯化后的HBc－L2蛋白免疫BALB／c小鼠可获得针对L2抗原的高滴度抗体，且小鼠血清具有中和16和18型两种假病毒的中和抗体活性。结论：HBc－L2病毒样颗粒可以有效地增强L2抗原的免疫原性，并可刺激机体产生针对多型HPV的免疫保护力，是一个具有潜力的新型广谱HPV疫苗。
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HDAg与HBsAg/HBcAg在丁型肝炎病人肝组织中的表达
研究HDAg、HBsAg和HBcAg在丁型肝炎病人肝组织中表达及关系,探讨HDV致病机理.应用免疫组化双重染色及连续切片技术,检测79例丁型肝炎病人肝组织HDAg、HBsAg和HBcAg表达,以52例乙型肝炎作对照.丁型肝炎HBsAg、HBcAg检出率(81%、71%)较乙型肝炎(94%、92%)低(P＜0.05或0.01).HDAg以肝细胞核表达为主,HBsAg以肝细胞浆表达为主,HDAg和HBsAg表达强度及阳性细胞分布呈一致性,均与肝组织炎症活动和病理损害程度相关(P＜0.01).HBcAg以肝细胞核表达为主,HBcAg阳性细胞明显少于HDAg阳性细胞.HDV感染可抑制HBV抗原表达;在HDV致病机制中既有HDV的直接细胞毒性作用,也有HBV和HDV的协同作用.
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应用pQE30系统表达和纯化乙型肝炎病毒核心抗原
目的建立高效、快速、简便的表达和纯化HBcAg系统,为进一步研究HBcAg在乙型肝炎发病机理中的作用及HBV C基因变异产生HBcAg特征.方法应用pQE30系统在原核细胞表达和纯化HBcAg.结果目的蛋白表达量占细菌总蛋白的26.2%;500ml诱导表达的菌液可得平均5mg的HBcAg;纯化的HBcAg纯度可达到91.0%;免疫印迹分析,表达的HBcAg具有多克隆抗-HBc结合活性.结论建立了一套高效、快速表达和纯化HBc Ag系统.
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乙型肝炎病毒感染肾炎患者肾组织病毒抗原和复制中间体的检测及其意义
目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)感染者肾组织中三种病毒抗原成分的分布特点及其与HBV感染状态和临床病理之间的联系,探讨在肾组织局部是否存在HBV的复制.方法:免疫组化法检测合并HBV感染的30例膜性肾病和12例膜增生性肾炎病例的肾活检组织切片中的HBsAg、HBcAg和HBeAg,同时检测肾小球和循环中的HBV基因组DNA及其复制中间体--闭合环状双链DNA(cccDNA).结果:膜性肾病肾组织中病毒抗原的检出率(83.3%)显著高于膜增生性肾炎(33%);膜性肾病肾组织检出的抗原以HBcAg和HBeAg多见,其中,血清HBeAg阳性病例肾组织HBeAg的检出率显著高于HBeAg阴性的病例.膜增生性肾炎肾组织检出的抗原主要是HBeAg.肾组织HBeAg的检出与循环中HBeAg的存在明显相关.伴血清转氨酶升高者肾组织HBV抗原的检出率较转氨酶正常者有升高的趋势.肾小球HBV DNA和cccDNA的检出均与循环中的检测结果高度一致,并以伴活动性HBV感染者检出率为高.结论:在合并HBV感染的肾炎患者中,肾组织HBV抗原的检出率在膜性肾病患者明显高于膜增生性肾炎.肾小球中检出的HBV抗原成分以HBeAg和HBcAg多见,肾小球HBeAg的检出与血清中是否存在HBeAg明显相关.合并肝功能损害者肾组织HBV抗原的检出率较肝功能正常者有增高趋势.在乙肝相关性肾炎患者的肾小球中确实能检测到HBV复制中间体的存在,它的出现与循环中HBV复制中间体检出的高度一致性,不能排除循环中HBV感染细胞在肾组织潴留对结果的影响,其意义还有待进一步阐明.
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一种新型的具有免疫调节和介导DNA基因治疗的蛋白质载体的研制
目的:研制一种具有调节宿主免疫系统,同时又能包装核酸进入肿瘤细胞的新型蛋白质载. 方法:利用基因工程技术,将人乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的-COOH端和靶向肿瘤的整和素配体RGD肽与谷胱甘肽还原酶(GST)在大肠埃希菌中融合表达,经分子筛和GST亲和纯化后,获得DNA包装蛋白GST-RGD-ΔHBcAg.此包装蛋白用FITC标记后与前列腺癌PC-3细胞孵育,观察进入细胞情况;并用此包装蛋白包装含绿色荧光蛋白GFP基凶的DNA载体pEGFP-N1,转染PC-3细胞,观察绿色荧光蛋白表达.此外,用包装蛋白GST-RGD-ΔHBcAg免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,检测m清IgG1和IgG2a抗体水平. 结果:本研究应用原核表达系统成功地表达并纯化出DNA包装蛋白GST-RGD-AHBcAg;荧光显微镜下观察到包装蛋白GST-RGD-AHBcAg能进入到PC-3细胞,并能携带绿色荧光蛋白基凶进入PC-3细胞并表达;该包装蛋白免疫BALB/c小鼠后,小鼠血清IgG1和IgG2a抗体水平同时升高. 结论:本研究研制的DNA包装蛋白GST-RGD-ABcAg可作为基因治疗载体,并能对宿主的免疫系统起调节作用,为肿瘤的免疫--基因治疗载体提供一个新的选择.
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可承载CETP多肽表位的颗粒样蛋白表达载体的克隆、表达与分离纯化
为了提高多肽表位的免疫原性,利用乙肝病毒核心抗原能够在体外自行组装成病毒样颗粒的特性,将人源胆固醇酯转运蛋白羧基端26个氨基酸连同大肠杆菌DnaK基因C端结构域克隆入乙肝病毒核心抗原的免疫优势决定区,并在大肠杆菌BL-21(DE3)表达,以包含体形式存在,经过洗涤、复性和分子筛纯化,获得纯度达90%以上的目的蛋白.纯化的蛋白免疫新西兰大白兔后能够诱导产生高水平的抗胆固醇酯转运蛋白的抗体,表明乙肝病毒核心抗原能够在体外自发装配成多聚体颗粒,并能够将插入其免疫优势决定区的胆固醇酯转运蛋白(CETP)多肽表位展示于颗粒表面以提高免疫原性,显示出其作为疫苗免疫载体的良好前景.
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慢性乙型肝炎患者肝组织内HBcAg表达的临床研究
目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织内HBcAg的表达与肝组织的炎症、纤维化程度、血清中的HBV DNA、HBsAg以及HBeAg定量之间的关系.方法 选择安徽医科大学第一附属医院2013年3月至2014年3月收治的103例CHB患者,按病理学结果分为S1组(36例)和S2～3组(67例).利用免疫组化技术检测肝细胞内HBcAg的表达,同时利用FirbScan仪器测定患者的肝纤维化程度.结果 在S2 ～3组中,肝组织HBcAg的表达与血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平及肝纤维化指标均呈现显著的相关性(P＜0.05),在S1组中均无显著相关(P＞0.05).结论 HBcAg在肝细胞中的表达与机体血清中DNA、HBsAg、HBeAg水平及无创肝纤维化程度存在一定的相关性.
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拉米夫定抑制乙肝患者精细胞内HBcAg表达的相关临床研究
[目的]探讨乙肝患者精细胞内HBcAg表达与血清HBV DNA水平的相关性及拉米夫定对精细胞内HBcAg表达的抑制作用.[方法]选择2007年1月至2008年10月在济南市传染病医院就诊的门诊和住院的乙肝患者62例为乙肝组,22名HBV指标全部阴性的健康人为对照组,检测精细胞内的HBcAg;乙肝组同时检测血清HBV DNA.[结果]精细胞HBcAg定性检测阳性率,乙肝组为96.77%(SHBcI≤2.5者7例,2.6～4.9者18例·≥5者37例),22名健康对照均阴性.乙肝组中,精细胞HBcAg的表达及其高度表达者所占比例,血清HBV DNA高者高于血清HBV DNA低者(P<0.01).精细胞HBcAg定量值,乙肝病人拉米夫定治疗的23例治疗后低于治疗前(P<0.01)·未治疗组10例高于治疗组治疗后(P<0.01).[结论]乙肝患者精细胞HBcAg表达与血清HBVDNA水平显著相关·拉米夫定治疗可减少精细胞内HBcAg的表达.
关键词： 乙肝病毒核心抗原 精细胞 乙肝病毒脱氧核糖核酸 拉米夫定 -
慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA定量与病情的相关性分析
目的 探讨肝组织HBV cccDNA定量对慢性乙型肝炎(乙肝)患者病情的影响.方法 应用 FQ-PRC法检测42例乙肝患者肝组织HBV cccDNA、肝组织和血清HBV-DNA水平,同时对肝组织行常规病理染色判断肝组织炎症及纤维化程度; SP法检测肝组织中HBsAg、HBcAg表达,化学发光法检测HBV标志物.分析肝组织HBV cccDNA与组织和血清HBV-DNA、肝细胞内HBsAg、HBcAg水平及肝脏炎症、纤维化程度的关系.结果 肝组织HBV cccDNA定量与组织及血清HBV-DNA定量呈正相关(r=0.807,P＜0.001;r=0.627,P＜0.001);与肝组织炎症活动度及纤维化程度无明显相关性; 肝组织HBV cccDNA定量与肝细胞内HBsAg表达无明显相关性,而与HBcAg表达呈正相关(r=0.486,P＜0.05).结论 检测肝组织内HBV cccDNA可更精确反映HBV复制程度;对乙肝诊断、抗病毒治疗及选择停药时机具有重要价值 .肝组织HBV cccDNA与血清HBV-DNA定量及HBcAg联合检测可指导抗病毒治疗.
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携带泛素-HBcAg融合基因的慢病毒表达载体构建及其体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟
目的 构建携带泛素-HBcAg融合基因的慢病毒表达载体,包装成重组慢病毒并观察其体外诱导小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟.方法 PCR扩增Ub-HBcAg融合基因,插入到慢病毒骨架质粒pWPXLd中,构建重组质粒pW-Ub-HBcAg.将构建的重组慢病毒质粒pW-Ub-HBcAg和包装质粒psPAX2、包膜质粒PMD2.G用脂质体共同转染293T细胞,获得携带Ub-HBcAg基因的重组慢病毒LV-Ub-HBcAg,并检测其在293T细胞中的表达.体外分离培养小鼠髓源性DC,加入重组慢病毒,流式细胞仪测定DC表面分子表达,ELISA测定DC培养上清中IL-12分泌水平.结果 强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒表达载体经测序证实目的 基因序列及插入方向均正确,Western blot能检测到目的蛋白在293T细胞中的表达.LV-Ub-HBcAg能上调DC表面分子的表达(CD86、CD80、MHC-Ⅱ类分子),并且能促进DC分泌IL-12(139.2±10.75)pg/mL,明显高于LV-HBcAg组分泌的量(P＜0.01).结论 成功构建了携带强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒,转染293T细胞后能够稳定表达目的基因,并且能诱导DC分化、成熟,上调表面共刺激分子的表达,促进IL-12因子的分泌.
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插入CpG序列的乙肝病毒核心抗原基因真核表达质粒的构建及在树突状细胞中的表达
目的:构建pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISS)真核表达载体,探讨乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在树突状细胞(DC)中的表达,为研制乙肝治疗性疫苗奠定基础.方法:根据HBcAg基因序列,设计合成两对引物,在引物中引入针对人敏感的CpG基序和不含CpG的片段,用PCR方法从慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA中扩增出HBcAg基因片段,将扩增产物与pEGFP-N1连接,构建重组体pEGFP-N1/CpG-HBcAg,进行酶切、PCR及测序鉴定;分离人外周血单个核细胞(PBMC),体外诱导分化为DC,通过脂质体将重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg和空载体分别转染DC,Western blot检测HBcAg在DC的表达.结果:HBcAg基因体外扩增产物大小为530bp.所构建的pEGFP-N1/CpG-HBcAg经双酶切及PCR鉴定,与预期片段的大小相符.测序结果与GenBank 中收录的HBcAg全长序列一致,表明pEGFP-N1/CpG-HBcAg真核表达体构建正确;PBMC体外成功刺激分化为DC,HBcAg可在DC中表达.结论:成功构建了真核重组表达载体pEGFP-N1/CpG-HBcAg,且可在DC中表达,为CpG的功能研究和乙型肝炎治疗性疫苗的研制奠定基础.
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插入CpG序列的乙肝病毒核心抗原基因真核表达质粒的构建及鉴定
目的 构建pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss)基因真核表达载体,为研制乙肝治疗性疫苗奠定基础.方法 根据乙肝病毒核心抗原基因序列,设计合成3对引物,在引物中引入分别针对人、鼠敏感的CpG片段和不合CpG的片段.用PCR方法从慢性乙肝患者血清DNA中扩增出乙肝核心抗原基因片段,将扩增的产物与真核表达质粒pZeoSV2(+)连接,构建重组体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS),进行酶切、PCR及测序鉴定.结果 乙肝核心抗原基因体外扩增产物大小约为530bp.所构建的pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(1ss)重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片段的大小相符;测序结果与GenBank中收录的HBcAg全长序列一致,表明pzeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS)真核表达载体构建正确.结论 成功地构建了真核重组表达载体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss).为CpG的功能研究和乙肝治疗性疫苗的研制提供了物质基础.
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乙肝病毒核心抗原展示载体的原核表达与电镜检测
目的 将多克隆酶切位点MCS插入乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的loop区,构建乙肝病毒核心抗原展示载体.方法 将多克隆酶切位点MCS插入到HBcAg的c/e1 loop区,取代了HBcAg c/e1 loop区的Pro79与Ala80氨基酸残基,成功构建了pET28a-HBcAg-MCS原核表达载体,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用不同IPTG浓度梯度进行原核诱导表达与NI-NTA亲和层析纯化,利用SDS-PAGE电泳和透射电镜检测.结果 成功表达了HBcAg-MCS融合蛋白,且佳的IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,利用镍柱纯化得到了较纯的HBcAg-MCS融合蛋白,进一步利用负染法透射电子显微镜检测到HBcAg-MCS融合蛋白呈现病毒样颗粒结构.结论 HBcAg-MCS融合蛋白能够自发形成病毒样颗粒结构,为乙肝核心抗原HBcAg作为展示载体的广泛应用打下基础.
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丁型肝炎病人肝组织HDAg与HBsAg/HBcAg和HBV DNA表达及关系
目的:探讨丁型肝炎病人肝组织中HDAg与HBsAg/HBcAg和HBVDNA表达及关系.方法:应用免疫组化双重染色和原位杂交,检测79例丁型肝炎病人肝组织HDAg、HBsAg、HBcAg和HBVDNA表达,以52例乙型肝炎作对照.结果:丁型肝炎HBsAg、HBcAg检出率(81%、71%)较乙型肝炎(94%、92%)低(P< 0.05或0.01).HDAg以肝细胞核表达为主,HBsAg以肝细胞浆表达为主,HDAg和HBsAg表达强度及阳性细胞分布呈一致性,且与肝组织的炎症活动和病理损害程度相关(P< 0.01).HBcAg以肝细胞核表达为主,阳性细胞主要呈单个细胞或点状分布,且HBcAg阳性细胞明显少于HDAg阳性细胞.HDAg表达强度与HBVDNA表达呈负相关(P< 0.05).结论:HDV感染会抑制HBV DNA复制或病毒抗原表达;在HDV致病机制中既有HDV的直接细胞毒性作用,也有HBV和HDV的协同作用.
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用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原基因中的突变
目的:利用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因中的突变碱基.方法:针对构建的重组质粒PGEM-7Z/HBcAg中的两处突变设计三对引物,PCR定点突变后对重新构建的PGEM-7Z/HBcAg进行菌落PCR和酶切鉴定,初步筛选的阳性克隆进一步通过序列分析进行确证.结果:经PCR定点突变后,测序证明HBcAg基因序列与设计完全一致.结论:用该方法成功纠正了人工合成的乙肝病毒核心抗原基因中两个碱基的缺失,获得了预期的目的基因.
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重叠PCR合成乙型肝炎病毒核心抗原基因及其在大肠杆菌中表达
DS-PAGE分析显示目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的64.3%.结论:应用重叠PCR合成HBcAg基因并在大肠杆菌中获得了高效表达.
