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共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5和M蛋白增强DNA疫苗免疫应答的研究
为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5基因)及ORF6为候选基因,构建了单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI ORF5m、pCI-ORF6及pCI-ORF5m/ORF6.转染BHK-21细胞,Western blot检测证实ORF5m和ORF6基因均获得正确表达,并且共表达的GP5m和M蛋白能够形成异源二聚体.将构建的表达质粒免疫小鼠,首免后6周共表达ORF5m和ORF6基因的pCIORF5m/ORF6免疫组小鼠血清中和抗体全部阳转,8周时高可达到1:32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答,明显高于单独表达ORF5m基因的pCI-ORF5m免疫组.进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI-ORF5m/ORF6免疫组同样能诱发优于pCI-ORF5m免疫组的中和抗体和细胞免疫反应.上述研究结果表明采用ORF5m和ORF6双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA疫苗效力,为PRRSV新型疫苗的研制提供了有用的数据.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5m ORF6 双基因共表达 DNA疫苗 -
成骨诱导双基因共表达腺病毒载体的构建
目的 探讨用一条Link序列T2A连接骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因构建含目的 基因的腺病毒载体的可行性.方法 先从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段,再接于Link序列T2A的两端.通过T2A Peptide的互补.延伸得到BMP2-T2A-bFGF的全长PCR产物,利用上游引物的Bgl Ⅱ酶切位点和下游引物的EeoRV酶切位点将其插入到pShuttle-IRES载体中,酶切、测序鉴定;利用同源重组技术将目的 基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体,鉴定阳性克隆;将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞,观察GFP表达,PCR鉴定后进行大量扩增,并用CsCl梯度离心法进行纯化;测量A260,计算病毒感染滴度.结果 克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确.经BglⅡ和EeoR Ⅴ双酶切得到的BMP2-bFGF 2个基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中;转染293A细胞2周后观察到明显的GFP聚集表达,即病毒包装成功,扩增纯化后滴度为3.6×1011 VP/ml.结论 经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功.
关键词： 骨形态发生蛋白-2 碱性成纤维细胞生长因子 双基因共表达 T2A序列 腺病毒 -
hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的 构建hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础.方法 通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF_(165)基因片段,并克隆到pMD-19T载体.将目的 基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF_(165)依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上.线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒.脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒.重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化.通过荧光计数确定病毒感染滴度.结果 克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF_(165)基因的PCR产物,滴度测定为5×109 pfu/mL.结论 成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础.
关键词： hBcl-2基因 hVEGF165基因 双基因共表达 腺病毒载体 -
人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定
目的构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体.方法利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig-IRES2-EGFP转染PA317细胞,在G418选择压力下,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA317细胞克隆, MTT法测定CTLA4Ig生物学活性. 结果成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响. 结论 IRES序列调控CTLA4Ig与EGFP双基因在细胞中同时独立表达.
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组织激肽释放酶与基质金属蛋白酶抑制剂在血管重构中的研究进展
血管重构是动脉粥样硬化、高血压、血管再狭窄等血管重塑性疾病的病理生理过程.近年来研究表明,细胞因子和生长因子诱导的血管平滑肌细胞发生表型转化,丧失收缩功能并获得增殖、迁移和分泌细胞外基质的能力是该类疾病形成与发展的根本原因.现就组织激肽释放酶或基质金属蛋白酶抑制物,对血管重构的影响及其基因治疗在血管重构中的研究进展进行综述,为抗血管重塑性疾病提供新的治疗思路.
关键词： 血管重构 组织激肽释放酶 基质金属蛋白酶抑制剂 基因治疗 双基因共表达
