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脑源性神经营养因子(rBDNF)转基因小鼠载体的构建和体外表达
目的 构建大鼠脑源性神经营养因子(rBDNF)的条件性转基因小鼠载体,鉴定其在体外细胞系中的表达.方法 用PCR方法扩增rBDNF片断,插入pNAO载体(lox-Stop-lox-IRES-EGFP),构建成rBDNF条件性基因载体(lox-Stop-lox-rBDNF-IRES-EGFP),使用Fugene 6转染试剂,将其同Cre重组酶表达质粒pGK-Cre共同导入HEK-293细胞系中,通过荧光显微镜观察、PCR 及ELISA方法确定Cre-lox同源重组. 结果 经酶切和测序鉴定,rBDNF条件性基因载体构建成功.共转染后的HEK-293细胞中,观察到绿色荧光蛋白(EGFP)的强荧光表达;细胞基因组DNA中检测到Cre-lox基因重组;对rBDNF定量检测的ELISA结果显示,细胞内有大量的rBDNF释放到细胞外. 结论 rBDNF条件性基因载体构建成功,在体外细胞系中,检测到rBDNF及EGFP强表达,为转基因显微注射打下基础.
关键词： 大鼠脑源性神经营养因子 条件性基因敲除 脑 增强绿色荧光蛋白 -
大鼠脑源性神经营养因子的克隆及原核重组表达载体的构建
目的：构建重组表达载体pGEX-脑源性神经营养因子（BDNF），探讨其原核表达BDNF的可行性。方法：大鼠BDNF进行密码子优化，人工合成BDNF的全基因序列，经回收、纯化、酶切后连接到pGEX原核表达载体中，将重组质粒pGEX-BDNF转化大肠杆菌BL21细胞中，筛选阳性克隆，经IPTG诱导表达后，利用ELISA方法鉴定其表达的活性。结果：PCR鉴定及测序显示BDNF序列完全正确，BDNF基因的克隆和表达载体构建成功，IPTG诱导表达目的蛋白经ELISA检测，其表达的目的蛋白具有一定的活性。结论：经密码子优化后经人工合成得到BDNF基因片段并成功构建pGEX-BDNF重组表达载体，具有一定的生物活性。
关键词： 大鼠脑源性神经营养因子 密码子优化 表达载体构建 ELISA检测
