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人Boca病毒外壳蛋白VP2在杆状病毒中的表达及病毒样颗粒的构建
为了得到结构与功能更接近于天然病毒的人Boca病毒(HBoV)主要外壳蛋白VP2,将来源于北京急性呼吸道感染患儿标本(BJ3722)的HBoV VP2基因编码区克隆至杆状病毒表达转移载体(pFastBac1),通过转座反应获得重组Bacmid DNA,以这种DNA转染昆虫细胞Sf9.收获重组病毒及其昆虫细胞培养物,经SDS-PAGE并应用兔抗HBov VP2高价免疫血清进行Western blot,以检测所表达的VP2蛋白,昆虫细胞经重组病毒感染后7～10d细胞完全裂解时,收获培养上清(VLPs-A),或在感染后4～5d细胞裂解前收获细胞并将其裂解(VLPs-B),经两次40%的蔗糖垫超速离心,所得的样品经Western blot和间接免疫荧光方法(IFA)检测,以确定VLPs的组分,然后应用免疫电镜观察病毒样颗粒的形态结构.通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测,均可检测到分子量约61kD的目的蛋白;通过IFA在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中检测到特异性荧光,表明HBoV VP2蛋白得到了表达并具有抗原特异性.纯化后的样品在电镜下可见类似于天然细小病毒B19的直径20nm左右的具有空壳结构的球形颗粒.本研究成功构建了HBoV VP2重组杆状病毒,得到了具有抗原特异性的HBoV VP2蛋白表达并形成了HBoV的VLPs.
关键词： 人Boca病毒 外壳蛋白VP2 重组杆状病毒 病毒样颗粒(VLPs) -
口蹄疫感染与免疫动物鉴别诊断方法的建立
目的 建立鉴别自然感染口蹄疫动物和口蹄疫灭活疫苗免疫动物的诊断方法.方法 构建重组杆状病毒的转座质粒pFastBac-3AB,转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-3AB;将Bacmid-3AB转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒.以重组杆状病毒表达的3AB蛋白为抗原建立鉴别口蹄疫感染与免疫动物的ELISA诊断方法,并对各种反应条件进行优化,包括抗原包被时间、包被浓度、封闭剂、酶标抗体工作浓度等.结果 获得了重组杆状病毒,成功表达了口蹄疫病毒3AB蛋白,并用纯化的3AB蛋白建立了检测口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法.用该方法检测FMDV感染动物和免疫动物血清抗3AB蛋白抗体,猪和牛感染血清检测的阳性率分别为83.3%和91.7%.结论 用纯化的口蹄疫病毒3AB蛋白建立了鉴别诊断口蹄疫感染与免疫动物的ELISA诊断方法.
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昆虫细胞偏爱密码子优化的HPV16L1基因在昆虫和哺乳动物细胞中的表达
目的 获得有效表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1基因的重组杆状病毒和腺病毒,为研究HPV的免疫保护机制提供材料. 方法 按照昆虫细胞密码子偏爱优化并合成HPV16L1基因,利用Bac-to-Bac昆虫表达系统获得表达HPV16L1基因的重组杆状病毒,利用AdEasy腺病毒载体系统获得表达HPVl6L1基因的重组腺病毒载体.通过间接免疫荧光和Western blot对HPV16L1基因表达进行鉴定,利用负染电子显微镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成.结果 获得了稳定表达HPV16L1蛋白的重组杆状病毒和重组腺病毒载体,在Sf9细胞和293细胞中可有效表达能被抗HPV16L1单克隆抗体识别的L1蛋白,分子质量单位为56 ku,在Sf9细胞中可观察到VLP的形成. 结论按照昆虫细胞密码子偏爱进行优化的HPV16L1基因,在昆虫细胞和哺乳动物细胞内均可有效表达.
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HPV16 L1-E7c嵌合基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中表达及免疫小鼠的效应研究
目前,关于人乳头瘤病毒疫苗的研究主要集中在嵌合型病毒样颗粒(cVLP)上.本研究制备了昆虫细胞表达的HPV16 L1-E7c CVLP,并将该蛋白疫苗接种动物,探讨其诱发体液免疫应答和细胞因子的效应.
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采用杆状病毒表达系统表达EGFP标记的HPV-16L1病毒样颗粒
目的 制备增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人乳头状瘤病毒16型(HPV-16)病毒样颗粒,为研究HPV-16L1的生物学活性提供一种方法.方法 采用Xbal+HindⅢ双酶切pGEM-T-HPV-16质粒,获得HPV-16L1基因片段,用PCR法从pEGFP质粒中扩增EGFP基因片段,NcoⅠ+SalⅠ双酶切,依次克隆入杆状病毒转移载体,获得重组pFB-EGFP-HPV-16L1转移载体;在DH1OBac内通过转座子Tn7的介导,获得重组Ac-EGFP-HPV-16L1杆状病毒;感染Sf-9昆虫细胞;荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法确定融合蛋白的荧光特性及细胞学定位;利用Western blot分析融合蛋白的表达;电子显微镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成;利用小鼠红细胞凝集试验及凝集抑制试验分析生物学活性.结果 重组pFB-EGFP-HPV-16L1辅助表达载体及重组杆状病毒中EGFP-HPV-16L1融合基因构建正确;荧光显微镜和激光共聚焦显微镜证实感染重组杆状病毒Ac-EGFP-HPV-16L1的Sf-9细胞核内可见耀眼的绿色荧光,免疫组织化学证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白主要位于Sf-9细胞核内;Western blot证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白相对分子质量(Mr)为83×103,与理论值一致;透射电子显微镜观察发现感染重组Ac-EGFP-HPV-16L1杆状病毒的Sf-9细胞核内和裂解上清内均可发现大量形态均一的VLP形成;小鼠红细胞凝集试验证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白可引起小鼠红细胞凝集,且可被抗HPV-16L1单克隆抗体抑制.结论 杆状病毒表达系统表达的EGFP标记的HPV-16L1蛋白既能自组装成病毒样颗粒、具有构象依赖性生物学活性,又能发射易于检测的绿色荧光,有可能用于HPV-16L1蛋白的生物行为研究,并实时可视化追踪其在宿主细胞内的转运过程.
关键词： 人乳头状瘤病毒16型 重组杆状病毒 增强型绿色荧光蛋白 病毒样颗粒 融合蛋白 -
人乳头瘤病毒16 L1/E7CTL重组杆状病毒载体的构建及鉴定
目的 研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1/E7CTL重组杆状病毒载体. 方法 以包含HPV16标准病毒株的质粒pHPV16为模板,采用PCR技术扩增HPV16主要衣壳蛋白L1(1-471aa)的基因序列,同时人工合成E7蛋白CTL表位E749-57的编码序列,将两个目的基因逐步连接构建重组质粒pUC19HPV16L1/E7CTL,HPV16L1/E7CTL片段经质粒pFast Bac1转位至Bacmid DNA后通过PCR鉴定重组杆粒. 结果 成功构建了包含融合基因HPV16L1/E7CTL片段的克隆质粒pUC19HPV16L1/E7CTL,制备了L1/E7CTL重组杆状病毒载体杆粒BACMIDDNA. 结论 采用分子克隆技术构建了包含L1/E7CTL的重组杆粒BACMID DNA,有利于下一步融合蛋白的表达,制备一种能够更有效激发CTL杀伤作用的嵌合病毒样颗粒疫苗,为疫苗研制打下基础.
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重组杆状病毒介导的DNMT1 siRNA对人胰腺癌细胞增殖影响的研究
目的:研究利用重组杆状病毒介导的DNMT1 siRNA对人胰腺癌细胞增殖的影响.方法:培养人胰腺癌细胞并分组如下:空白对照组、阴性对照组、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)、r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组).空白对照组仅加10%胎牛血清和DMEM培养基培养,阴性对照组、D1组、D2组、D3组加血清和DMEM培养基培养24h后依次加入空白载体r-Bac-CMV-EGFP和r-Bac-si-DNMT1-D1病毒、r-Bac-si-DNMT1-D2病毒、r-Bac-si-DNMT1-D3病毒150μl/孔,72h后分别收集各组细胞用MTT法测肿瘤细胞增殖的变化.结果:重组杆状病毒介导的DNMT1 siRNA感染的细胞存活率较空白对照组和阴性对照组明显降低(P<0.05).结论:杆状病毒介导的DNMT1 siRNA感染人胰腺癌细胞后能通过降低细胞存活率,从而影响胰腺癌细胞的增殖.
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百日咳毒素S1亚单位缺失分子的构建及其在重组杆状病毒中的表达
目的:为探明羧基端疏水区对百日咳毒素S1亚单位分泌性的影响,试图构建缺失羧基端疏水区的S1亚单位.方法:应用PCR技术构建了6种不同信号序列修饰的缺失羧基端疏水区的S1亚单位编码基因,并使用重组杆状病毒(rBV)技术实现了这些缺失S1亚单位(tS1)在昆虫细胞中的高水平表达.结果:这些缺失S1亚单位的表达量为每万个昆虫细胞1.01～2.25 μg.细菌信号肽和流感病毒HA信号肽均能完整表达和正确剪切,但HA信号肽在昆虫细胞中的处理效率更高.结论:tS1亚单位缺失羧基端疏水区后在昆虫细胞中的表达量明显提高,这些tS1亚单位的异源性表达是由于信号肽剪切不全所导致,tS1分子表观分子量的漂移并不意味着信号肽剪切不正确.
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重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及其免疫特性分析
目的 利用重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,并分析该蛋白的免疫特性.方法 将PCV2 Cap基因克隆至转移载体pFastBac Ⅰ,转化感受态E.coli DH10Bac细胞,获得重组杆粒rBacmid-Cap,转染Sf9细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测重组杆状病毒,并于High Five(H5)细胞中进行高效表达.将小鼠随机分为PBS对照组、杆状病毒组、重组杆状病毒组及疫苗对照组,均经小鼠肌内注射,100 μL/只,分别于第0和14天进行免疫,于首免后第21、28、35及42天经小鼠眼眶静脉丛采血,分离血清,ELISA法进行检测.结果 PCR和测序分析结果表明,重组转移质粒和重组杆粒构建正确.重组PCV2 Cap蛋白的相对分子质量约28 000,可与抗His标签单克隆抗体及抗PCV2 Cap多克隆抗体发生特异性结合.重组杆状病毒按MOI=5及1感染H5细胞约72 h,PCV2 Cap蛋白表达量高,表达产量约150 μg/mL.首免后第21、28、35及42天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于PBS对照组及杆状病毒组(P＜0.001);首免后第21、28、35天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于疫苗对照组(P＜0.05),首免后第42天,两组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功利用杆状病毒表达系统高效表达了PCV2 Cap,重组蛋白可诱导小鼠产生较高水平抗体,本研究为PCV疫苗的研制奠定了基础.
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丙型肝炎病毒E1、E2蛋白表达及诊断丙型肝炎的临床研究
丙型肝炎病毒(ECV)基因编码的E1和E2是病毒体包膜糖蛋白,该蛋白在昆虫细胞中已成功进行表达[1,2].本研究应用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达HCV包膜糖蛋白E1和E2,并用于丙型肝炎患儿血清抗体检测.
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杆状病毒表达SARS冠状病毒核蛋白抗原性的研究
目的对杆状病毒表达SARS冠状病毒NP抗原性进行分析与比较.方法利用SDS-PAGE、Western-Blot 和ELISA证明重组核蛋白(rSN)在昆虫细胞获得高效表达,具有特异免疫反应原性.结果表达rSN的昆虫细胞裂解、稀释后直接包被ELISA板,来检测SARS-CoV康复病人血清特异抗体,敏感性稍高于Vero细胞培养的全病毒(OD分别为2.8和0.6),与健康人血清不发生特异反应 (OD值为0.01);表达rSN昆虫细胞用于间接免疫荧光,快速检测血清特异抗体反应,同样表现了良好的敏感性和特异性.结论昆虫细胞表达rSN有望替代SARS-CoV全病毒,作为安全、敏感和特异的诊断抗原,应用于ELISA和IFA血清学检测.
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新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用
用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF.鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFast Bac I载体中,得到重组转移载体pFast-NDF.然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF.再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒.间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用.动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体.本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础.
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携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性
用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cryIAc10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP, 用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白.同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133.3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量高.生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的.
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双拷贝v-cath基因的重组HaNPV的构建及毒力分析
利用HaNPV的Bac-to-Bac系统(Hanpvid)构建了双拷贝v-cath基因的重组HaNPV,即:除病毒自身的v-cath基因外,还带有由ie1启动子控制的早期表达v-cath基因的重组病毒dciHaNPV.Dotblot和Northernblot分析证明:重组病毒构建正确.用重组病毒感染Hz-AM1细胞,测定了dciHaNPV的TCID5o为3.16×107 TCID50/mL.
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Norwalk和Norwalk-like病毒胃肠炎
诺瓦克病毒(Norwalk virus, NV)和诺瓦克样病毒(Norwalk-like viruses, NLVs)是引起人类急性病毒性胃肠炎(即无菌性胃肠炎)的重要病原,既往由于缺乏检测手段及NV不能在组织中培养,限制了其临床的深入研究,近年来随着分子生物学技术的发展,已成功地用重组杆状病毒系统表达NV结构蛋白,这种纯化的结构蛋白在体外形成的病毒颗粒与天然病毒的抗原性极为相似,使对NV的研究取得了新的突破.已证实NV在婴幼儿及大龄儿童中均有很高的感染率.本文就NV概况、流行病学特点、免疫学、分子生物学特征,临床表现及检测方法等新进展进行综述.
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呼吸道合胞病毒融合蛋白F在重组杆状病毒表达系统中的表达及抗原性研究
目的 利用杆状病毒表达系统对RSV A型Long株F基因进行表达研究,为RSV重组亚单位疫苗的研制奠定基础.方法 用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增F基因,将其克隆到pFastBacHT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PER鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western-blot试验.免疫Balb/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT试验检测T淋巴细胞增殖.结果 目的 蛋白F在昆虫细胞中有特异性表达,能被F蛋白单克隆抗体所识别,该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体.结论成功克隆RSV F基因,并在Sf9昆虫细胞中获得表达,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础.
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重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫
目的:构建新型的马传染性贫血病毒(EIAV)的候选疫苗.方法:利用BAC-To-BAC杆状病毒表达系统,将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗(EIAV DLV)及其亲本株(EIAV LN)env基因导入到杆状病毒基因组中.转染昆虫细胞后,得到的重组病毒用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物.以本实验室构建的含有EIAV env基因的重组痘苗病毒,单独或与重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白联合免疫小鼠.结果:构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白.与单独免疫组相比,联合免疫组免疫应答显著增强,其中中和抗体的滴度提高5～9倍.结论:含有EIAV env基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫,能够诱导高滴度的中和抗体.
关键词： EIAV Env蛋白 重组杆状病毒 重组痘苗病毒 免疫应答 -
HCV CE2融合蛋白在家蚕培养细胞、蚕幼虫中的表达及其初步应用
目的:高效表达HCV CE2融合蛋白并进行初步应用. 方法:将2a型HCV全长CE2基因的cDNA重组于质粒pBacPAK8,构建重组转移载体pBacPAK-CE2,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)DNA共转染家蚕培养细胞株,构建重组病毒. 双酶切及PCR鉴定重组病毒基因组中目的片段的表达. 重组病毒感染BmN细胞株及五龄家蚕幼虫后,SDS-PAGE分析细胞培养上清、细胞抽提物及幼虫体液样品中,HCV CE2融合蛋白的特异性条带. 并用间接ELISA法初步检测表达产物的生物活性. 结果:双酶切及PCR鉴定重组病毒基因组含有约1.6 kb的目的片段,重组病毒感染后的BmN细胞培养上清、细胞抽提物及幼虫体液样品中,均可见一Mr约90×103的特异性条带;用间接ELISA检测证明表达产物具有较好的免疫原性. 结论:HCV CE2融合基因在家蚕培养细胞及蚕幼虫中获得了高效表达,并具有生物活性,为进一步进行疫苗的研究及临床诊断试剂的开发奠定基础.
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杆状病毒疫苗载体的应用研究进展
人源病毒基因载体存在的记忆免疫和毒性阻碍了其在临床上的应用.自从发现杆状病毒能够有效进入多种哺乳动物细胞系和原代细胞后,其在基因治疗中的应用引人注目,候选杆状病毒载体迅速兴起.在哺乳动物细胞中,杆状病毒既不能复制也不能引起明显的细胞毒性作用,不存在哺乳动物病毒载体的相关记忆免疫.另外,含有新的穿梭启动子且包膜修饰的重组杆状病毒在体内的转导效率大幅度提高.在非人源病毒载体中,杆状病毒已成为新颖的令人瞩目的疫苗载体.
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不同脊髓灰质炎病毒株3CD蛋白酶在昆虫细胞中的表达及其对P1前体蛋白的剪切
目的 获得在昆虫细胞中有效表达脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的重组杆状病毒,为制备脊髓灰质炎病毒样颗粒疫苗提供了科学依据.方法 将I型脊髓灰质炎病毒( Mahoney株) 的P1基因和3CD基因构建到供体质粒中,通过flashBAC ULTRATM系统制备重组杆状病毒;将Mahoney株的P1基因与Sabin株Ⅲ 型的3CD基因组合,用同样方法构建重组杆状病毒.通过接种昆虫细胞草地贪夜蛾细胞( sf-9细胞) 对两种病毒进行扩增,再接种昆虫细胞粉纹夜蛾细胞( High five细胞) 扩大培养,并通过定量PCR对P1和3CD基因的表达进行验证,利用Western blot检测P1蛋白的表达及被3CD蛋白酶剪切的情况.结果 获得了两株稳定表达脊髓灰质炎病毒P1和3CD基因的重组杆状病毒.其中,重组杆状病毒( BacU-Mahoney-P1-3CD) 在感染细胞后,3CD蛋白酶表达量较低,不能有效剪切P1前体蛋白;而重组杆状病毒( BacU-Mahoney-P1-Sabin PV3 3CD) 感染细胞后,3 CD蛋白酶的表达量和对P1前体蛋白的剪切效力都有明显提高( P＜0.05).结论将Mahoney株P1基因和Sabin株Ⅲ 型的3CD基因的组合构建重组杆状病毒,可有效地在昆虫细胞中表达P1和3CD基因,并且Sabin株Ⅲ 型的3CD蛋白酶可有效地剪切Mahoney株的P1前体蛋白.
