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电针影响坐骨神经损伤大鼠脊髓前角神经营养因子-3表达的研究
目的：观察电针对坐骨神经损伤大鼠神经营养因子-3表达的影响，探究分析电针促进坐骨神经损伤的修复机制。方法采用大鼠坐骨神经夹持损伤模型，依据随机数字表分为正常组、假手术组、模型组、模型对照组、电针组，通过免疫组化和积分光密度测定脊髓前角神经营养因子-3表达，通过BBB( Basso Beattie Bresnahan)评分、坐骨神经功能指数观察大鼠的行为学变化，综合分析坐骨神经损伤大鼠运动功能的改变。结果造模后7天，采用单因素ANOVA进行组间比较及SNK法进行两两比较。模型组、电针组与正常组相比行为学检测提示坐骨神经损伤大鼠的运动功能明显降低(P<0．05)。电针干预后，电针组与模型组相比BBB评分明显升高(P<0．05)，神经功能恢复情况优于模型组；坐骨神经功能指数取值高于模型组，但无统计学差异( P>0．05)。模型组、电针组神经营养因子-3表达与正常组相比均有统计学差异(P<0．05)，电针组神经营养因子-3表达与模型组相比有显著差异(P<0．05)。结论电针可以通过促进神经营养因子-3的表达，抑制神经细胞凋亡，促进周围运动传导通路再通和功能恢复，终改善坐骨神经损伤大鼠的运动功能。
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TRKC基因体外转染大鼠神经干细胞的方法
目的 探讨体外转染TRKC基因的神经干细胞的制备方法.方法 利用自行合成的引物进行PCR反应,定向克隆构建TRKC-cDNA质粒并进行DNA测序分析,将pEGFP-C1质粒和TRKC-cDNA质粒进行酶切、重组,构建出pEGFP-C1-TRKC质粒.用脂质体将重组质粒转染到体外培养的大鼠神经干细胞中.用Western blot、免疫荧光和MTr法观察转染基因的表达和转基因后神经干细胞的增殖活性.结果 成功构建了TRKC-cDNA质粒,DNA测序证明所获得的目的基因与公布序列的一致性为99%,所获得的重组子符合研究要求.pEGFP-C1-TRKC质粒转染到神经干细胞后,宿主细胞能高效、稳定地表达目的基因产物GFP和TRKC.在NT-3作用下转TRKC基因神经干细胞的增殖活性有明显增强.结论 以质粒为载体、脂质体为介导可成功地把TRKC基因转染到神经干细胞内,转染基因表达好且具有功能.
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灵芝孢子对大鼠脊神经腹根切断后脊髓运动神经元存活及其NT-3、NOS表达的影响
目的探讨灵芝孢子(萌动激活赤灵芝孢子)对大鼠脊髓受损伤运动神经元存活和表达神经营养素-3(NT-3)及一氧化氮合酶(NOS)的影响.方法对单侧腹根切断后的大鼠胃饲不同剂量的灵芝孢子,计算受损伤运动神经元存活率;用免疫组织化学及原位杂交方法检测NT-3的表达;用酶组织化学方法检测NOS的活性.结果腹根切断后35 d,对照组运动神经元存活率为47.32%,灵芝孢子低、中、高剂量组的运动神经元存活率分别为67.11%、72.67%和81.67%;腹根切断后高剂量组存活的运动神经元NT-3和NOS的表达都高于对照组. 结论灵芝孢子促进大鼠脊髓前角受损伤的运动神经元存活,其存活率与用药剂量有关;灵芝孢子促进大鼠脊髓存活的运动神经元表达NT-3和NOS.
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NT-3基因修饰及维甲酸预诱导的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处分化为神经元样细胞的研究
目的 探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能.方法 将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的MSCs分别立即移植到脊髓全横断处(T10脊髓),术后67d取材和冷冻切片,用免疫荧光组织化学染色方法检测MSCs的分化潜能,计算各细胞移植组脊髓损伤处的MSCs分化为神经元样细胞的百分率.结果 移植的MSCs在受损伤的脊髓内可分化为神经干细胞(nestin阳性)、神经胶质样细胞(GFAP阳性)和神经元样细胞(NF和MAP2阳性),有些还可以向含有某种神经递质和有形成突触潜能的神经元样细胞分化(ChAT、5-HT和PSD95阳性).联合应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在受损伤的脊髓内更有效地提高MSCs向神经元样细胞分化的百分率.结论 NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在脊髓损伤处更好地分化为神经元样细胞.
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人神经营养素-3基因重组腺病毒载体的构建、表达和生物活性检测
目的构建具有生物活性的人神经营养素-3(NT-3)基因重组腺病毒表达载体.方法从人脑组织mRNA中扩增NT-3基因全长cDNA,定向克隆于穿梭质粒pShuttle中,获得一个带有CMV启动子的质粒.再与腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)体外连接,形成重组腺病毒质粒(pAd-NT-3).用pAd-NT-3转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Adeno-NT-3). 结果NT-3基因RT-PCR扩增产物约801 bp.Adeno-NT-3 PCR鉴定为正确重组子.RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA及Western blot检测显示,Adeno-NT-3能在其转染的293细胞表达和分泌NT-3.这种NT-3能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞. 结论应用体外连接法成功构建了人NT-3基因重组腺病毒表达载体,其表达产物具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞的活性作用.
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NT-3基因修饰施万细胞促进移植的神经干细胞在损伤脊髓内分化为神经元样细胞
目的探讨神经营养素-3(NT-3)基因修饰施万细胞(SCs)对植入全横断性脊髓损伤处的神经干细胞(NSCs)分化为神经元样细胞的影响.方法将NSCs单独移植或与NT-3基因修饰SCs、LacZ基因修饰SCs和SCs联合移植到全横断性脊髓损伤处,67 d后用免疫组织化学方法观测NSCs的分化,并计算其中神经元样细胞的分化率.结果NSCs在损伤脊髓内可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与未基因修饰的SCs的作用相比,NT-3基因修饰的SCs能更有效地提高NSCs向神经元样细胞的分化率,而LacZ基因修饰的SCs与未修饰SCs没有明显区别.结论NT-3基因修饰SCs能促进NSCs在损伤脊髓内向神经元样细胞分化.
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神经营养素-3基因修饰骨髓间充质干细胞的明胶海绵圆柱体支架移植促进大鼠全横断脊髓损伤部分结构和功能修复的研究
目的:探讨神经营养素-3(NT-3)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)的明胶海绵圆柱体支架移植对大鼠全横断脊髓损伤部分结构和功能修复的影响。方法:选取15只SD大鼠，随机分成3组:①NT-3基因修饰MSCs联合明胶海绵圆柱体支架移植组(NT-3-MSCs组);②MSCs联合明胶海绵圆柱体支架移植组(MSCs组);③单纯明胶海绵圆柱体支架移植组(control组)。在脊髓全横断后施行上述支架移植，在一定时间点比较3组动物功能恢复情况及其脊髓损伤区的结构变化。结果:M-3-MSCs组BBB功能评分、移植的MSCs存活数、神经丝蛋白-200(NF-200)阳性纤维计数和平均空洞面积均优于其余组别(P＜0.05)。结论:NT-3基因修饰MSCs联合明胶海绵圆柱体支架移植能够促进大鼠脊髓损伤部分结构和功能的修复，为临床治疗脊髓损伤提供实验依据。
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督脉电针与NSCs移植联合应用对大鼠脊髓全横断损伤组织NT-3含量及受体表达的影响
目的:探讨督脉电针与神经干细胞(NSCs)联合应用对大鼠脊髓全横断损伤组织神经营养素-3(NT-3)含量及其受体表达的影响.方法:将30只成年大鼠分为对照14d组、督脉电针14d组(电针14d组)、神经干细胞移植14d组(NSCs 14d组)、督脉电针+神经干细胞移植14d组(电针NSCs 14d组)、神经干细胞移植30d组(NSCs 30d组)和督脉电针+神经干细胞移植30d组(电针NSCs 30d组)6组,所有动物均实施T10段脊髓全横断手术,其中电针组和电针NSCs组于术后5d进行电针治疗.结果:①电针NSCs14d组受损伤的脊髓组织含有较高水平的NT-3,其次是电针14d组和NSCs14d组,对照14d组受损伤的脊髓组织含有较低水平的NT-3.②NSCs30d组和电针NSCs30d组脊髓全横断处的移植神经干细胞均有TrkC表达.结论:督脉电针与神经干细胞移植联合应用能够明显增高大鼠脊髓全横断损伤处邻近组织的NT-3水平;在大鼠脊髓损伤处及邻近组织有些移植神经干细胞表达TrkC.
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电针对慢性期脊髓损伤大鼠功能恢复及神经营养因子表达的影响
目的:研究督脉电针对慢性期脊髓损伤大鼠功能康复及神经营养因子的表达的影响,探讨督脉经上不同穴位电针的作用是否存在差异.方法:将32只雄性SD大鼠随机分为4组:假模组、模型对照组、头部督脉电针组(“百会、风府”)、背部督脉电针组(“大椎、命门”),每组8只.建立大鼠脊髓损伤模型,各治疗组于术后l周开始6周的电针治疗.采用BBB运动功能评分法评定大鼠后肢运动功能的恢复情况.术后7周处死大鼠,采用实时荧光定量PCR及Western-blot方法检测受损脊髓脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)mRNA和蛋白的表达.结果:电针干预组BBB评分高于模型组(P＜0.05),且背部督脉电针组评分明显高于头部督脉电针组(P＜0.05).电针治疗后大鼠脊髓BDNF及NT-3 mRNA和蛋白的表达与模型对照组比较均明显上调(均P＜0.05),且背部督脉电针组高于头部督脉电针组(P＜0.05).结论:电针治疗能增强受损伤脊髓神经营养因子的表达和促进大鼠后肢运动功能的恢复,背部督脉电针组作用强于头部督脉电针组.
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神经干细胞与NT-3基因修饰雪旺细胞联合移植促进全横断脊髓损伤大鼠功能修复的实验研究
目的:探讨神经干细胞(NSCs)与神经营养素-3(NT-3)基因修饰雪旺细胞(SCs)联合移植对全横断脊髓损伤大鼠的后肢运动及神经传导功能修复的作用.方法:将NSCs与NT-3基因修饰SCs或未基因修饰SCs联合移植,或NSCs单独移植到大鼠全横断性脊髓损伤处,60d后进行爬网格测验和BBB评分检测运动功能.第67d,进行皮质运动诱发电位(CMEP)和皮质感觉诱发电位(CSEP)检测脊髓的神经传导功能.结果:脊髓损伤大鼠后肢的运动功能及CMEP和CSEP的修复程度依次为NSCs与NT-3基因修饰SCs联合移植组,NSCs与未基因修饰SCs联合移植组,NSCs单独移植组和实验对照组.结论:NSCs与NT-3基因修饰SCs联合移植能够促进脊髓损伤后大鼠的后肢运动及神经传导功能的修复.
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神经营养素-3基因修饰雪旺细胞和神经营养素-3受体基因修饰脊髓间充质干细胞联合移植促进脊髓损伤大鼠神经元存活的研究
目的:探讨神经营养素-3(NT-3)基因修饰雪旺细胞(SCs)和神经营养素-3受体(TrkC)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)联合移植对全横断脊髓损伤(SCI)大鼠的大腩皮质感觉运动区、红核和背核受损伤神经元存活的影响,为细胞治疗和基因治疗的临床应用提供依据.方法:将含有NT-3-SCs和TrkC-MSCs的PLGA高分子支架移植到大鼠脊髓全横断损伤处.在术后第67天,取其大脑和脊髓进行冷冻切片.用免疫荧光组织化学染色方法,榆测SCI处SCs和MSCs的存活及其外源性基因的表达,并计算大脑皮质感觉运动区内锥体细胞层、中脑红核和L1脊髓背核的神经元数量.结果:2个月后.可见SCI处有移植的SCs和MSCs,其中转染的外源性基因NT-3和TrkC可在移植细胞内表达.NT-3-SCs+TrkC-MSCs移植组大脑皮质感觉运动区内锥体细胞层、中脑红核和L1脊髓背核的神经元数量明显高于其他组. 结论:NT-3基因修饰SCs和TrkC基冈修饰MSCs联合移植能够促进全横断SCI大鼠的人脑皮质感觉运动区、中脑红核和脊髓背核受损伤神经元的存活.
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神经营养素-3基因修饰嗅鞘细胞移植对急性脊髓损伤作用的实验研究
目的:观察神经营养素-3(NT-3)基因转染嗅鞘细胞(OEG)移植对急性大鼠脊髓损伤的作用.方法:将自行构建的质粒pEGFP-NT3应用脂质体介导的方法导入体外培养的嗅鞘细胞,并移植入急性脊髓损伤大鼠体内,连续观察12周,与接受单纯OEG、空白质粒转染OEG移植的脊髓损伤大鼠进行比较.结果:移植转染pEGFP-NT3后的OEG能在体内长期存活,表达NT-3基因,与对照组比较能更好地促进脊髓损伤区轴突的再生和后肢功能的恢复.结论:OEG是脊髓损伤基因治疗较好的受体细胞.转染NT-3基因的OEG移植后可以在体内较长时间存活,能明显促进急性脊髓损伤神经纤维的再生和功能恢复,为基因修饰嗅鞘细胞在脊髓损伤治疗中的应用提供了实验和理论依据.
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神经营养素-3对大鼠急性脊髓损伤后Bcl-2和Bax表达的影响
目的:观察神经营养素-3(NT-3)对大鼠急性脊髓损伤后B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)表达的影响,探讨NT-3对脊髓损伤的作用及其可能的分子机制.方法:105只SD大鼠随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)和NT-3治疗组(C组),每组35只.B、C组用改良Allen's法以30g·cm致伤大鼠T8脊髓制作损伤模型,C组经蛛网膜下腔导管于术后即刻、4h、8h、12h、24h、3d、7d注入NT-3 20μl(含NT-3 200ng),B组在相同时间点给予等量生理盐水;A组打开椎板后蛛网膜下腔置管,不损伤脊髓,不给药.术后24h、3d、7d、14d对大鼠进行脊髓运动功能(BBB)评分.于术后4h、8h、12h、24h、3d、7d、14d处死动物(n=5),取T8节段脊髓,甲苯胺蓝(Nissl)染色观察脊髓前角运动神经元变化情况,用免疫组织化学方法检测Bcl-2和Bax在脊髓前角运动神经元中的表达变化情况.结果:各时间点C组和B组大鼠BBB评分均显著低于A组(P＜0.01),但C组显著高于B组(P＜0.05或0.01).Nissl染色C组大鼠脊髓损伤区较B组出血少、残存神经元多,A组正常.各时间点C组和B组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bax阳性细胞平均光密度(AOD)值均显著高于A组(P＜0.01),但C组显著低于B组(P＜0.05或0.01);各时间点C组和B组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bcl-2阳性细胞AOD值均显著低于A组(P＜0.01),但C组显著高于B组(P＜0.05或0.01).结论:NT-3可能通过抑制Bax表达,提高Bcl-2表达,抑制脊髓损伤后神经元凋亡,从而保护损伤的脊髓组织,这可能是NT-3对脊髓损伤具有保护作用的机制之一.
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两种神经营养因子对噪声性毛细胞损伤协同防护作用的观察
目的观察胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)和神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)对噪声引起毛细胞肌动蛋白损伤的协同防护作用.方法采用改进的豚鼠耳蜗微渗透压泵慢性灌注技术,将GDNF和NT-3缓慢注入12只豚鼠左侧内耳,以左耳灌注人工外淋巴液的9只豚鼠为对照,检测噪声暴露后豚鼠听功能和耳蜗毛细胞缺失率的变化.结果动物术后14 d(噪声暴露后10 d)实验组手术耳和非手术耳的脑干诱发电位反应(auditory brainstemresponses,ABR)阈值低于对照组(秩和检验,下同.P＜0.05,P＜0.01),毛细胞表皮板和纤毛肌动蛋白荧光染色计数发现实验组手术耳和非手术耳外毛细胞缺失率均低于对照组(P＜0.001,P＜0.01),内毛细胞缺失率也均低于对照组(P＜0.01,P＜0.01).结论 GDNF和NT-3对噪声性聋具有较好的协同防护作用.
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神经营养素-3对腺样囊性癌细胞体外迁移能力的影响
目的研究神经营养素-3对人涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M体外迁移能力的影响.方法应用Transwell培养小室测定不同浓度NT-3对ACC-M细胞的体外迁移能力的影响.结果 ACC-M细胞与2.5,5,10 ng/ml的NT-3共培养10 h后迁移细胞数均明显多于未加NT-3组;而与浓度为100 ng/ml的NT-3共培养10 h后迁移细胞数却明显少于未加NT-3组.结论 NT-3对ACC-M细胞体外迁移能力的影响存在浓度依赖性.一定浓度的NT-3能够增强ACC-M细胞的体外迁移能力.
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人腺样囊性癌细胞系体外NT-3分泌水平的测定
目的 研究体外培养的ACC细胞系中神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)的分泌情况.方法 应用酶联免疫吸附测定法检测NT-3在ACC细胞系体外的分泌水平.收集ACC-M、ACC-2、M3SP4、L929 4个细胞系无血清培养的上清液,用ELISA法检测上清液中NT-3的含量.将各组细胞培养上清液中NT-3的分泌水平采用SNK-q检验进行实验组之间、实验组与对照组之间的多重比较.结果 阴性对照组未检测到NT-3的表达;ACC-M、ACC-2细胞培养上清液中NT-3的分泌水平与阴性对照组比较有显著统计学意义(P<0.01);M3SP4及L929细胞培养上清液中NT-3的分泌水平与阴性对照组比较无显著统计学意义(P>0.05).ACC的两个细胞系ACC-M、ACC-2细胞分别与其他细胞系(人粘液表皮样癌高转移M3SP4细胞系、小鼠肺纤维瘤L929细胞系)NT-3的分泌水平两两比较均存在显著性差异(P<0.01).ACC-M细胞培养上清液中NT-3的含量与ACC-2细胞比较无显著性差异(P>0.05).结论 体外培养的ACC细胞能分泌一定浓度的NT-3,NT-3可能在ACC的嗜神经侵袭中发挥重要作用.
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GDNF和NT-3对噪声性毛细胞损伤的防护作用--细胞核形态学观察
观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和神经营养素-3(NT-3)对噪声性毛细胞损伤的防护作用.将GDNF和NT-3缓慢注入内耳,以灌注人工外淋巴液动物为对照,检测噪声暴露后耳蜗毛细胞核形态、数量的变化.噪声暴露10天后,毛细胞核荧光染色计数发现,实验组手术耳和非手术耳耳蜗外毛细胞核肿胀率明显低于对照组(P＜0.01).研究表明,GDNF和NT-3对噪声性毛细胞损伤具有较好的防护作用.
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腺病毒介导的hNT-3基因转染对兔前交叉韧带重建术后本体感觉恢复的影响
目的:探讨腺病毒介导的入神经营养素3(hNT-3)基因转染对兔前交叉韧带损伤重建术后本体感觉恢复的影响.方法:42只日本大耳白兔随机分成A、B、C三组,单侧后肢膝关节制造前交叉韧带损伤后自体半腱肌肌腱移植的动物模型.A、B两组自体半腱肌肌腱移植物内分别用微量注射器多点注射腺病毒载体Ad hNT-3与腺病毒空载体Ad GFP,C组注射生理盐水作为对照.术后48 h,分别从A、B、C三组中取自体肌腱移植物做冰冻切片,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况.术后8周、16周、24周,分别从A、B、C三组中取标本做电生理学指标检测、免疫组织化学染色和HE染色,观测体感诱发电位(SEPs)、肌电图(EMG)和本体感受器.结果:荧光显微镜下观察,A、B两组中可见绿色荧光蛋白表达,C组中未见.相同的时间点,A组本体感受器的数目多于B、C两组,体感诱发电位和肌电图的潜伏期短于B、C两组,波幅高于B、C两组,差异有统计学意义(P＜0.05),而B、C两组中各观测指标相比较无明显统计学差异(P＞0.05).结论:腺病毒介导的hNT-3基因转染能够促进前交叉韧带损伤重建术后自体肌腱移植物内本体感受器的再生和本体感觉的恢复.
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糖皮质激素对哮喘患儿的临床疗效及作用机制研究
目的 探讨吸入型糖皮质激素对哮喘患儿的临床疗效及作用机制.方法 90例哮喘患儿随机分为试验组与对照组,各45例.对照组给予常规治疗,试验组在常规治疗基础上给予吸入型糖皮质激素治疗,5岁以下患儿给予丙酸氟替卡松气雾剂100.0~250.0 μg· d-1雾化治疗,每天2次;5岁以上患儿给予布地奈德气雾剂200.0~400.0 μg· d-1雾化治疗,每天2次. 连续治疗4周,观察2组患儿的临床疗效和血清神经营养素-3、外周血嗜酸性粒细胞的变化.结果 试验组总有效率为95.56%,对照组总有效率为71.11%,试验组显著优于对照组( P<0.05 ). 治疗后,试验组与对照组血清神经营养素-3和外周血嗜酸性粒细胞较治疗前显著降低,试验组降低程度较对照组更显著( P<0.05 ).结论 哮喘患儿治疗的过程中加用糖皮质激素能提高临床疗效,其机制可能是降清血清神经营养素-3和外周血嗜酸性粒细胞计数,控制气道炎症反应.
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人神经营养素-3基因克隆及原核表达
目的 通过基因工程的方法克隆人神经营养素-3成熟蛋白(hNT-3)的基因,并在大肠杆菌中进行表达,为研究hNT-3的生物学作用提供材料.方法 以人胎脑cDNA为模板,采用PCR方法扩增hNT-3基因,并将其克隆在pGEM-T载体上,将经过序列分析确定的hNT-3基因插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达载体pGEX-6p-1-NT-3,用SDS-PAGE法测定其在大肠杆菌中的表达.结果 经序列测定分析,所克隆DNA片断与文献发表序列(GenBank,MW002527)同源性为99.7%,并获得了高效表达hNT-3蛋白的重组菌株.结论 体外成功扩增hNT-3基因,并在原核细胞中高效表达.
