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虎杖苷联合生长因子诱导人脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究
目的:探讨虎杖苷联合生长因子诱导人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)向神经元样细胞分化的过程.方法:采用原代组织贴壁法,体外分离培养hUC-MSC,流式细胞术鉴定hUC-MSC表面标志物.不同剂量虎杖苷联合生长因子诱导后显微镜下观察细胞形态变化,应用荧光定量PCR方法检测神经元特异性标志物3型β微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ)、微管相关蛋白2(MAP2)和孤束核受体相关因子1(Nurr1)的表达,细胞免疫荧光技术检测β-tubulin-Ⅲ的蛋白表达.结果:hUC-MSC高表达CD29、CD44、CD105,极低表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR.诱导后部分hUC-MSC分化为典型的神经元样细胞,并且β-tubulin-Ⅲ、MAP2基因表达经诱导后显著上调.Nurr1 mRNA仅在高剂量虎杖苷联合生长因子组显著上调.不同剂量虎杖苷联合生长因子组均有部分细胞表达β-tubulin-Ⅲ,对照组几乎不表达.结论:虎杖苷能够诱导hUC-MSC分化为神经元样细胞,且存在剂量依赖性,为hUC-MSC移植治疗神经系统疾病提供了实验依据.
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清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞
目的:观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞.方法:将21只四周SD大鼠依照随机性原则分成三组,即空白对照组、β-巯基乙醇组以及清脑灵组,各组均为7只.通过贴壁法分离获得大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达.清脑灵组用浓度为l mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,而β-巯基乙醇组则使用β-巯基乙醇诱导MSCs,空白对照组不进行任何处理,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:流式细胞仪检测显示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示Nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞.结论:清脑灵能诱导MSCs分化成神经元样细胞.
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刺五加注射液体外诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经样细胞的佳浓度探索
目的 探讨刺五加注射液体外诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经样细胞的佳浓度.方法 体外密度梯度法分离培养骨髓基质细胞,以不同浓度刺五加注射液对其进行体外诱导,用MTT法检测各组细胞生长情况,用免疫细胞化学方法计算各组神经样细胞阳性数加以比较.结果 用不同浓度刺五加注射液诱导后均可表现为典型的神经样细胞形态,其中0.3mg/ml组和0.4mg/ml组细胞生长情况与免疫组化结果均与其余各组差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 刺五加注射液体外诱导成年大鼠骨髓基质细胞分化为神经样细胞以0.3～0.4mg/ml浓度佳.
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人脐血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞
目的 从人脐血中分离单个核细胞(MNCs)、体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和定向诱导能力. 方法 无菌条件下采集脐血,肝素抗凝,分离单个核细胞.用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养,分别向神经元样细胞诱导,获取MSCs,显微镜下观察它的形态、尼氏体染色;取扩增2、5、7代的MSCs,免疫细胞化学法检测nestin表达和神经元样细胞特异性标记. 结果 诱导扩增后的MSCs尼氏体染色阳性,第2、5、7代MSCs的nestin的阳性表达率分别为(51.2±3.2)%、(34.6±2.7)%、(11.3±3.3)%;神经元特异性烯醇化酶(NSE)在原代细胞无表达,而在2、5、7代MSC的阳性表达率分别为(11.4±2.3)%、(21.78±3.1)%、(40.7±3.4)%. 结论 人脐血MSCs具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化.
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鸡胚原始生殖细胞定向诱导分化为脂肪和神经元样细胞
目的 探索培养传代后鸡胚原始生殖细胞(EPGCs)的多向分化潜能,比较不同诱导程序、不同特异性化学诱导剂及其协同作用.方法 分别获取发育至19期和28期的鸡胚PGCs,体外培养传代到第4代.采用不同诱导程序、不同组合的诱导剂地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1.甲基黄嘌呤(IBMx)诱导EPGCs向脂肪细胞分化.采用不同诱导程序、不同组合的诱导剂维甲酸(RA)、丁化羟基苯甲醚(BHA)、IBMx、二甲基亚砜(DMSO)诱导EPGCs向神经元样细胞分化.结果 1.EPGCs被诱导7～21d后,分化成脂肪细胞,其中诱导程序(2)(见正文中叙述)的诱导分化效果较好,第19、28期分化率分别为89%和91%.诱导剂联合协同作用的诱导效果极显著地(P＜0.01)高于单独作用的诱导效果.诱导的脂肪细胞经特异性的油红O和苏丹红染色为阳性,并检测到特异性过氧化物酶体增生物激活受体?(PPAR-?)的表达.2.EPGCs被诱导3～7d后,分化成神经元样细胞.RA、IBMx单独使用对神经元样细胞的形成率分别为82%和83%,极显著地(P＜0.01)高于RA、BHA、DMSO和IBMX的协同作用的效果.诱导的神经元样细胞特异性免疫组织化学检测显示,均有神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白M(NFM)的表达,而无胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结论 鸡EPGCs体外培养传代后仍具有多向分化潜能,在特异化学物质的诱导下,可被定向诱导分化为脂肪细胞、神经元样细胞.
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NT-3基因修饰及维甲酸预诱导的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处分化为神经元样细胞的研究
目的 探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能.方法 将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的MSCs分别立即移植到脊髓全横断处(T10脊髓),术后67d取材和冷冻切片,用免疫荧光组织化学染色方法检测MSCs的分化潜能,计算各细胞移植组脊髓损伤处的MSCs分化为神经元样细胞的百分率.结果 移植的MSCs在受损伤的脊髓内可分化为神经干细胞(nestin阳性)、神经胶质样细胞(GFAP阳性)和神经元样细胞(NF和MAP2阳性),有些还可以向含有某种神经递质和有形成突触潜能的神经元样细胞分化(ChAT、5-HT和PSD95阳性).联合应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在受损伤的脊髓内更有效地提高MSCs向神经元样细胞分化的百分率.结论 NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在脊髓损伤处更好地分化为神经元样细胞.
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NT-3基因修饰施万细胞促进移植的神经干细胞在损伤脊髓内分化为神经元样细胞
目的探讨神经营养素-3(NT-3)基因修饰施万细胞(SCs)对植入全横断性脊髓损伤处的神经干细胞(NSCs)分化为神经元样细胞的影响.方法将NSCs单独移植或与NT-3基因修饰SCs、LacZ基因修饰SCs和SCs联合移植到全横断性脊髓损伤处,67 d后用免疫组织化学方法观测NSCs的分化,并计算其中神经元样细胞的分化率.结果NSCs在损伤脊髓内可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与未基因修饰的SCs的作用相比,NT-3基因修饰的SCs能更有效地提高NSCs向神经元样细胞的分化率,而LacZ基因修饰的SCs与未修饰SCs没有明显区别.结论NT-3基因修饰SCs能促进NSCs在损伤脊髓内向神经元样细胞分化.
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依达拉奉体外诱导骨髓间充质干细胞向经元样细胞分化
目的 采用密度梯度离心和差速贴壁法体外分离、培养、纯化及鉴定成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和依达拉奉联合诱导MSCs定向分化为神经元样细胞. 方法 选用1月龄健康雄性Wistar大鼠,采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓中的MSCs,通过差速贴壁法反复传代培养、纯化,取第3代细胞采用流式细胞术、免疫细胞化学等方法检测MSCs的纯度,利用bFGF联合依达拉奉诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过扫描电镜、免疫细胞化学等对诱导后的细胞进行鉴定. 结果 第3代MSCs经免疫细胞化学及流式细胞仪等检测,间充质干细胞特异性的标记物CD44表达阳性,不表达造血干细胞及白细胞的特异性标记物CD34、CD45,MSCs纯度高达95.5％.诱导分化后扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构；免疫细胞化学检测发现,细胞表达神经元特异性烯醇化酶( NSE),不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP),Nestin的表达随着细胞成熟而减弱. 结论 密度梯度离心和差速贴壁法可获得高纯度的MSCs；依达拉奉能高效地定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.
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大鼠胎血与骨髓非造血成体干细胞体外分化能力的比较
为了比较大鼠胎血和骨髓中非造血成体干细胞(non-hematopoietic adult stem cells, NASC)体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同, 在无菌条件下采集孕大鼠的胎血和成年大鼠的骨髓,用Ficoll-hypague分离液分离出单个核细胞(MNC)后,种植于含10%胎牛血清的DMEM/LG培养液内.收获的NASC传代培养,用流式细胞仪检测细胞的免疫表型.β-巯基乙醇(β-ME)、二甲亚砜(DMSO)和叔丁基对羟基茴香醚(BHA)诱导NASC向神经元分化,用免疫细胞化学染色检测其特异性标志巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果发现: 传代培养后的两种NASC的形态相似,皆呈均一的梭形;流式细胞仪检测结果示两种NASC的免疫表型无明显差异,表达CD44、 CD54,不表达CD11b、CD45;定向诱导的两种NASC具典型神经元形态,免疫细胞化学染色显示nestin和NSE为阳性,但GFAP为阴性.结论:大鼠胎血和骨髓非造血成体干细胞的细胞形态、生物学特性无明显差别;两者都可被诱导分化为神经元样细胞;胎血应是NASC的又一来源.
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神经节苷脂体外诱导骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞
目的 探讨神经节苷脂体外诱导骨髓基质干细胞(BMSC)向神经元样细胞分化的可能性.方法 分离培养人BMSC,采用含神经节苷脂的无血清培养基诱导BMSC的分化,免疫细胞化学方法鉴定诱导分化后细胞表面神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)的表达.结果 神经节苷脂诱导培养6 h后,细胞表现为典型神经细胞样形态,神经元特异性标志物NSE和NF呈阳性表达.结论 神经节苷脂可在体外诱导人BMSC分化为神经元样细胞.
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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的机制
目的探索骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导分化为神经样细胞的机制.方法分离培养大鼠MSCs,用二甲基亚砜(DSMO)和丁羟茴醚(BHA)诱导分化,检测诱导分化前、预诱导24 h、诱导分化后6 h、24 h和48 h神经细胞和神经干细胞的特异性标记蛋白的表达.结果诱导分化后,大部分MSCs变成双极、多极和锥形,并相互交织成网络结构,巢蛋白(Nestin)在诱导分化前不表达,在诱导分化后6 h达到高,24 h和48 h逐渐降低.神经元特异性核蛋白(NeuN)在诱导分化前不表达,在诱导分化后6 h出现表达,24 h和48 h表达增强.结论 MSCs经体外诱导先分化为神经干细胞,然后分化为神经元样细胞.
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骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及其在神经修复中的应用
近几年来,干细胞已成为生物学和医学领域的研究热点.间充质干细胞来源于中胚层,具有很强的自我更新、增殖能力以及多向分化的潜能.而骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenclaymal stem ceIls,BMSCs)因具有易于分离、培养、扩增、长期培养的过程中始终保持多向分化的潜能、免疫原性低、遗传背景稳定等特性,使之成为干细胞研究领域的焦点.近的研究表明BMSCs在体外能被诱导成神经元样细胞,且植入体内能改善神经损伤症状.因此,本文结合新研究进展就体外诱导BMSCs向神经元样细胞的分化及其在神经修复中的应用作一综述.
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新方案诱导大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞
目的 探索体外诱导间充质干细胞分化为神经元样细胞后长期培养的可能性.方法自成年Wistar大鼠红骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,通过克隆培养、成骨分化、成脂肪分化鉴定其特性,取第3代细胞重新接种,经b-FGF预诱导及β-巯基乙醇诱导后,换维持培养液维持培养.结果 本实验分离培养的细胞克隆形成率64±1.4%,具有成骨及成脂肪分化能力.成神经元诱导分化0.5h后,多数细胞即开始呈现出神经元样外观,5h后绝大多数细胞表现出典型的神经元样外观,维持培养1周后,大多数细胞继续维持神经元样外观,72±3.6 %的细胞MAP-2免疫细胞化学染色阳性.结论 本实验中分离培养的细胞表现出间充质干细胞的特性,经诱导后,超过半数的细胞分化为神经元样细胞,在我们优化的培养体系中,分化的神经元样细胞可存活1周以上.
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成人骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞后的维持培养
目的:探讨体外诱导成人骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)分化为神经元样细胞后长期培养的可行性.方法:自成人红骨髓分离培养BMSCs,通过克隆培养、成骨分化、成脂肪分化鉴定其特性,取第3代细胞重新接种,经碱性成纤维生长因子预诱导及β-巯基乙醇诱导后,换维持培养液维持培养,观察其分化及生长情况.结果:成神经元诱导分化0.5h后,多数细胞即开始呈现出神经元样外观,5h后绝大多数细胞表现出典型的神经元样外观,维持培养1周后,大多数细胞继续维持神经元样外观,免疫组织化学染色示65%±3.3%的细胞微管相关蛋白-2染色阳性,43%±2.1%的细胞神经微丝-160染色阳性.结论:成人BMSCs经诱导后半数左右的细胞可分化为神经元样细胞,在优化的培养体系中,分化的神经元样细胞可存活1周以上.
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皮肤源祖细胞体外诱导神经元样细胞的实验研究
目的 探讨皮肤源祖细胞的体外培养、鉴定及定向诱导成神经元的方法,为治疗中枢神经系统疾病提供理想的种子细胞.方法 取出生1～3 d的昆明鼠皮肤,分离培养出皮肤源祖细胞;皮肤源祖细胞以含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10%胎牛血清(FBS)的培养基中预诱导24h,再以含二甲基亚砜(DMSO)和3-叔丁基-4-羟基茴香醚(BHA)的培养基中诱导7 d;观察诱导细胞形态,以及免疫荧光鉴定细胞表达神经丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)情况;ELISA检测诱导细胞分泌神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)情况.结果 细胞诱导后呈多极性生长;细胞免疫荧光表达NF和NSE,GFAP表达阴性;随诱导时间延长培养液中BDNF和NGF浓度增加.结论 皮肤源祖细胞在特定条件下能定向分化为神经元,并且能提高神经生长因子和脑源性神经营养因子的分泌,能为组织工程皮肤和修复神经系统病变提供种子细胞.
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音速波状蛋白促进骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化
目的 探讨音速波状蛋白(Shh)促进人骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向分化为多巴胺能神经元样细胞的作用.方法 体外分离、扩增和鉴定人骨髓MSCs.采用不同诱导方案诱导MSCs向神经元和多巴胺能神经元样细胞定向转化后,进行抗神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运体(DAT)等免疫细胞化学染色,并计算阳性细胞百分率.结果 实验组诱导后MSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,可见NSE、Nestin、GFAP、TH和DAT等神经细胞标志表达;对照组MSCs细胞形态无明显变化,上述特异性标志物表达均为阴性.实验2组(诱导方案含Shh)与1组(诱导方案不含Shh)的NSE、Nestin、GFAP阳性细胞百分率的差异无统计学意义,但实验2组TH和DAT阳性细胞百分率明显高于实验1组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 Shh可促进MSCs分化为多巴胺能神经元样细胞.
关键词： 骨髓间充质干细胞 神经元样细胞 多巴胺能神经元样细胞 分化 音速波状蛋白 -
人骨髓间充质干细胞向胆碱能神经元定向分化的实验研究
目的 探讨人骨髓间充质干细胞(BMMSCs)体外定向分化为神经元的潜能.方法 体外分离和扩增人BMMSCs.利用扩增后的第2代BMMSCs分为诱导组和对照组.诱导组的细胞经预处理和预诱导后在含全反式维甲酸(ATRA)和音速波状蛋白(Shh)的完全培养基中诱导5 h, 对照组不加任何诱导剂.诱导后观察细胞形态变化,采用免疫细胞化学染色法检测神经元样细胞特异标志.结果 诱导组BMMSCs经诱导后均能分化为具有典型神经元形态的细胞,并表达神经元特异性烯醇化酶[NSE,(61.00±3.63)%]、胶质纤维酸性蛋白[GFAP,(14.42±2.74)%],且有相当部分神经元样细胞表达胆碱乙酰转移酶[ChAT,(9.92±1.29)%];对照组BMMSCs细胞形态无明显变化,上述特异性标志物表达也均为阴性.结论 BMMSCs可跨胚层分化为神经元样细胞和胆碱能神经元样细胞.
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不同补肾法对BMSCs向神经元样细胞分化的影响
目的 探讨不同补肾法对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法 分离、培养并鉴定BMSCs；不同补肾法代表方药含药血清孵育BMSCs,对诱导后细胞神经标志蛋白进行检测.结果 体外诱导5h、72 h时,与空白组、单纯右归丸组比较,其余各药物诱导组巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)均明显升高.结论 不同补肾法能够促BMSCs向神经元样细胞分化,且补阴类代表方左归丸和阴阳双补类代表方地黄饮子诱导分化的效果优于补阳类代表方右归丸.
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促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究
目的 探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) 的体外培养和向神经元样细胞分化的方法.方法 通过梯度分离获得成年大鼠MSCs ,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、神经丝蛋白(NF) 、胶质纤维酸性蛋白( GFAP) 和神经巢蛋白(Nestin) 的表达情况,流式细胞仪检测分析诱导率.结果 BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin.应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)所获得的神经元样细胞诱导率高(49. 7%).结论 bFGF、BHA能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.
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人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究
目的探讨人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)的体外分离、纯化、扩增和向神经元样细胞的定向诱导分化条件.方法无菌条件下采集正常人脐血,肝素抗凝,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞,进而获得MSC.用MesencultTM培养基进行纯化和扩增培养.用流式细胞仪检测MSC的表面标志.取扩增2,5,8代的MSC分别向神经元样细胞诱导,免疫组化和组化法检测神经元样细胞特异性标志和结构.结果脐血MSC每扩增一代,细胞数量增加约2～3倍.6.6×105个人脐血原代MSC在体外扩增10代后获得9.9×108个细胞,扩增约1.5×103倍.流式细胞仪检测结果显示,脐血MSC不表达CD34、CD11a和CD11b,强表达CD29,弱表达CD71,与骨髓MSC表面抗原特性一致.诱导后的细胞平均有70%左右呈现典型的神经元样表型,免疫组化法检测发现不同代数的MSC诱导后均表达神经丝蛋白(neurofilament, NF)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE);组织化学法检测可看到神经元特有结构尼氏体.结论脐血MSC在体外有较强的扩增能力,能够向非间充质类细胞分化.
