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脊髓性肌萎缩症患儿骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究
目的 脊髓性肌萎缩症(SMA)是一组常染色体隐性遗传性疾病,由于SMN基因的缺失或突变,导致脊髓前角细胞变性坏死,引起肢体近端肌肉无力和肌萎缩.该病至今无有效治疗,干细胞治疗可望给患者带来福音.该研究拟探讨SMA患者骨髓间质干细胞(MSCs)能否分化为神经元样细胞,从而为SMA的干细胞治疗提供实验依据.方法 用PCR-RFLP的方法对SMA患者进行基因诊断;分离和纯化患者的(MSCs),在bFGF预诱导后,再用黄芩甙诱导MSCs分化为神经元样细胞;用神经元标志物NSE和NF鉴定诱导的神经元样细胞.上述研究均与对照者进行对比.结果 PCR-RFLP证实所选患者SMN1基因外显子7缺失,而对照者无缺失;SMA患者和对照者的MSCs形态相同,增殖速度相似;两组MScs经黄芩甙诱导6 d后,大多数细胞转变为类似于神经元的形态,有长的突起,相互之间连接呈网状.免疫荧光染色鉴定两组分化后的神经元样细胞,NSE和NF均为阳性.结论 SMN1基因缺失不影响MSCs的增殖和分化,SMA患者的MSCs能够分化为神经元样细胞.
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BDNF基因转染促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化
目的:将脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)基因转入骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC),使其作为种子细胞和基因治疗的载体将BDNF基因导入脊髓损伤组织,为探索一种更为有效的脊髓损伤治疗方法提供实验基础.方法:分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞；实验组应用已构建的pEGFP-N 1-BDNF进行基因转染,空质粒组用pEGFP-N1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养基,并进行Western印迹分析；将转染BDNF的实验组、转染空质粒组和未转染的阴性对照组细胞在体外向神经元样细胞诱导分化,比较3组细胞诱导后神经元样细胞分化率,并进行统计学分析.结果:流式细胞检测培养细胞CD90(+),CD44(+),CD34(-)、CD45(-);经western印迹检测证实实验组MSC表达BDNF-EGFP;实验组细胞向神经元样细胞分化率高于空质粒组和未转染的阴性对照组,差异具有统计学意义(p＜0.05).结论:BDNF基因转染MSC后,可以促进其向神经元样细胞分化,BDNF在MSC向神经元样细胞分化过程中具有重要作用.
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增强型绿色荧光蛋白转染对大鼠骨髓间充质干细胞体外神经元样细胞分化的影响
目的:利用质粒载体将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells-rMSC),研究EGFP对rMSC体外诱导分化神经元样细胞的影响.方法:以质粒为载体将EGFP基因转染rMSC,流式细胞仪检测转染后rMSC的表面标志物,并对转染EGFP的rMSC在体外向神经元方向诱导分化.结果:转染EGFP基因的rMSC与未转染的rMSC在细胞形态学和生长特性方面一致.转染EGFP基因的rMSC在细胞表面标志物上符合rMSC的特点,呈CD44(+),CD11b(-),CD45( -),经体外培养后可诱导分化神经元样细胞,并且2组诱导分化神经元样细胞阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).结论:转染EGFP基因对rMSC在体外诱导分化神经元样细胞无明显影响,EGFP可作为研究rMSC分化潜能机制的有效示踪标志.
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三磷酸胞苷二钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究
目的 探讨三磷酸胞苷二钠(CTP)诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用.方法 取成年SD大鼠,用贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞(BMSCs),传代扩增,连续观察细胞形态及生长特性.用不同浓度(0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mg/mL)CTP对BMSCs进行诱导;诱导后用免疫组织化学检测细胞神经微丝蛋白(NF)、胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元烯醇化酶(NSE)的表达.计算阳性细胞比例,进行统计学分析,选出合适的诱导剂量.结果 随CTP浓度增高,经免疫组织化学检测NF、GFAP和NSE阳性细胞比例也呈现逐步增高趋势,到一定浓度后又有所下降,统计学分析,CTP浓度为02 mg/mL时,能够诱导NF、GFAP和NSE阳性细胞比例为(32.73±0.63)%、(62.77±2.45)%和(30.41±0.65)%,显著高于对照组(P＜0.01).结论 CTP是一种很好的体外诱导剂,可以诱导MSCs向神经细胞分化,以0.2 mg/mL CTP作诱导剂,能够获得较明显的诱导MSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化的结果.
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NGF和BME对小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用
目的探讨神经生长因子(NGF)β-疏基乙醇(BME)诱导小鼠骨髓间充质干细胞(mousenarrow mesenchmal stem cells,mMSCs)分化为神经元样细胞的作用.方法密度梯度离心结合差异贴壁法分离、纯化mMSCs,用血小板源性生长因子(Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB)和表皮生长因子(Epidermal Growth Facotro,EGF)刺激促进mMSCs分裂增殖.以NGF和BME为诱导剂,观察诱导期间细胞的形态变化,并用免疫细胞化学法鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,甲苯胺蓝色法显示尼氏小体.结果免疫细胞化学显示:70%细胞表达NSE,74%细胞表达NF;实验组行尼氏染色出现尼氏小体.结论NGF和BME能诱导mMSCs分化为神经元样细胞,而且具有较高的诱导效率.
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损伤脊髓组织提取液对大鼠肌源性干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究
目的:探讨大鼠肌源性干细胞在损伤脊髓组织提取液中向神经细胞分化的可能性,为神经再生及脊髓损伤的治疗提供一种新方法.方法:从大鼠乳鼠骨骼肌中分离培养肌源性干细胞,将正常、伤后1d,伤后1周及伤后3周脊髓提取液加入细胞培养基中,观察细胞形态的变化,并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达NSE特异性标志物.结果:加入脊髓提取液诱导后24h,部分细胞的形态已发牛改变,3 d后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征,而且NSE等特异性抗体呈阳性表达.结论:损伤脊髓组织液能将肌源性干细胞诱导成神经元样细胞.
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损伤脊髓组织液对大鼠骨髓基质细胞向神经细胞诱导分化的研究
目要:探讨成年大鼠骨髓基质细胞在损伤脊髓组织液中向神经细胞分化的可能性,为神经再生及脊髓损伤的治疗提供一种新方法.方法:从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞并传至第5代,将正常、伤后1 d,伤后1周及伤后3周脊髓提取液加入细胞培养基中,观察细胞形态的变化,并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达NSE特异性标志物.结果:加入脊髓提取液诱导后24 h,部分细胞的形态已发生改变,48 h后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征,而目NSE等特异性抗体呈阳性表达.结论:损伤脊髓组织液能将骨髓基质细胞诱导成神经元样细胞.
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体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞
目的 探讨体外培养的嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的影响.方法 实验分为OECs+MSCs共培养组和MSCs单独培养组,在7 d和14 d两时间点观察MSCs的分化情况.用p75抗体免疫细胞化学染色鉴定OECs细胞的纯度;用巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触后膜致密区蛋白(PSD)等抗体免疫细胞化学染色鉴定已分化的细胞表型.结果 体外培养的MSCs经OECs诱导后分化为神经元样细胞,这些细胞能够表达NF、MAP2和PSD等神经元标记物,而不表达星形胶质细胞标记物GFAP.在培养7 d,MSCs+OECs 7 d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs 7 d组比较有明显增高.在培养14 d,MSCs+OECs 14 d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs 14 d组比较,也有明显增高.结论 体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.
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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究
目的探索骨髓间充质干细胞(MSCs)能否在体外诱导分化成神经样细胞,并初步探讨其分化机制.方法培养大鼠MSCs,用二甲亚砜(DMSO)和丁羟茴醚(BHA)诱导分化,鉴定诱导分化前后的细胞是否表达神经细胞及神经干细胞的特异性标记蛋白,并研究其超微结构的变化.结果诱导分化后,大部分MSCs变成双极、多极和锥形,并相互交织成网络结构,出现神经元特异性核蛋白(NeuN)和巢蛋白(Nestin)表达,无胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和2-3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNP)表达.部分MSCs转变为典型的神经元超微结构.结论MSCs可以在体外诱导分化为神经元样细胞.
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超低频磁场基于ERK信号通路介导促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化
目的 探讨10 Hz超低频磁场(ELF-EMF)对离体培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的影响及其作用机制. 方法 应用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,流式细胞仪检测P3代细胞表面标记物.将P3代BMSCs分为ELF-EMF组、ELF-EMF+抑制剂组、抑制剂组及对照组,给予诱导培养基(含2％二甲基亚砜和200 μmol/L丁基羟基茴香醚)诱导培养5h,诱导过程中ELF-EMF组、ELF-EMF+抑制剂组给予10 Hz、500 GS ELF-EMF干预,ELF-EMF+抑制剂组、抑制剂组在诱导前预先加入50μmol/L U0126共培养30 min,使用倒置显微镜观察细胞形态学变化.应用免疫荧光染色及Western blotting检测各组细胞巢蛋白表达,应用Western blotting检测各组细胞内磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白表达水平. 结果 P3代BMSCs呈长梭形,漩涡样排列,CD90表达率为97.9％,CD45表达率为4.7％.诱导结束后细胞均逐渐出现典型的神经元样细胞形态学特征.免疫荧光染色及Western blotting检测结果显示,与对照组、ELF-EMF+抑制剂组及抑制剂组比较,ELF-EMF组巢蛋白、p-ERK1/2表达水平均明显增高,差异均有统计学意义(P＜0.05).ELF-EMF+抑制剂组巢蛋白表达水平与对照组及抑制剂组比较差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 ELF-EMF可通过活化ERK1/2信号转导通路,促进BMSCs向神经元样细胞分化.
关键词： 超低频磁场 骨髓间充质干细胞 神经元样细胞 细胞分化 细胞外信号调节激酶1/2 -
脐带血间充质干细胞移植对大鼠脑创伤的影响
目的 探讨脐带血间充质于细胞(CB-MSC)移植对脑创伤大鼠的治疗作用及其在体内分化为神经元样细胞的可行性.方法 健康Wistar大鼠采用随机数字表法分为3组:(1)损伤组,开颅钻孔打击脑组织不移植细胞;(2)移植对照组,开颅创伤脑组织后在创伤区注射生理盐水1.25μ;(3)CB-MSC移植组,开颅创伤脑组织后在创伤区注射含CB-MSC混悬液.每组各18只.CB-MSC从脐带血中分离、培养得到,采用BrdU标记.分别于移植后3 d及10 d进行大鼠行为学评分,2周和4周行Y迷宫试验.移植后2周和5周对植人脑内的CB-MSC进行免疫组织化学检测,镜下观察胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞.结果移植后10d 3组大鼠行为学评分差异有统计学意义(p<0.05),移植后2周和4周大鼠学习、记忆评分差异亦有有统计学意义(P<0.05).移植后2周和5周在CB-MSC移植组细胞移植区均发现BrdU-GFAP和BrdU-NSE阳性细胞,其他2组均未发现.结论 CB-MSC移植可促进大鼠脑创伤恢复,提高学习和记忆能力,CB-MSC在体内可以向神经元样细胞分化.
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不同方法诱导大鼠脂肪基质细胞定向分化为神经细胞的比较研究
目的 探索提高大鼠脂肪基质细胞(ADSCs)向神经细胞定向诱导分化比例的实验方法.方法 根据所采用的不同细胞诱导分化方法分为A组(直接诱导组:以含血清及神经营养因子的Neurobasal培养基直接诱导ADSCs向神经细胞分化)和B组[神经球诱导组:先以无血清Neurobasal培养基将ADSCs诱导为神经干细胞(NSCs)球,再以含血清及营养因子的Neurobasal培养基诱导神经球干细胞向神经细胞分化].通过细胞形态学观察以及免疫细胞化学检测巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)、微管相关蛋白2(MAP2ab)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,鉴定细胞分化结果.结果 免疫细胞化学结果证实,两组细胞均有效表达nestin和β-tubulinⅢ.A组细胞在诱导6 h时nestin表达可达高峰(73.8%±6.5%),并很快下降(24 h为50.3%±3.8%,72 h为10.5%±3.0%),72 h后即检测不到;β-tubulinⅢ在诱导后24 h开始表达(33.5%±6.6%),1周达高峰(84.3%±33%).B组nestin的高表达持续整个神经球阶段,β-tubulinⅢ在神经球阶段有少量表达(成球后7 d为14.1%±3.3%),神经球细胞分化后其表达明显增加(分化后3 d为46.4%±6.1%);B组存由NSCs向神经细胞诱导一定时间后可检测到一定比例的MAP2ab阳性细胞(24.5%).结论 ADSCs在体外稳定扩增传代并在适宜诱导条件下,可以向神经细胞定向分化.应用神经球诱导法和直接诱导法均可得到较高比例的nestin及β-tubulinⅢ阳性细胞,神经球诱导组nestin表达稳定,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现.
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骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞诱导分化潜力的比较研究
目的 比较骨髓源基质干细胞(BMSCs)和脂肪源间充质干细胞(ADSCs)向神经元样细胞诱导分化的潜力. 方法 体外分离培养来自成年SD大鼠的BMSCs和ADSCs,传至第5代时加入表皮生长因子(EGF,10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20ng/mL),诱导6 h、12 h、24h、72 h、1周、2周后,用免疫荧光染色和Westernblot检测两种细胞的神经细胞特异性标志(巢蛋白和β.微管蛋白Ⅲ)的表达,并做统计学分析. 结果 BMSCs和ADSCs经诱导后,细胞形态发生变化,均表达神经细胞特异性标志.免疫荧光染色结果显示诱导后各时间点BMSCs和ADSCsnstin阳性率或β.tubulin Ⅲ阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05),且诱导后ADSCs表达nestin阳性细胞或β.tubulinⅢ的能力在各个时间点都比诱导后BMSCs强.说明诱导后的ADSCs向神经元样细胞方向分化的能力更强.Western blot结果也与免疫荧光染色结果类似. 结论 两种不同来源的干细胞在分化成神经元样细胞方面的能力不同.ADSCs比BMSCs具有相对更强的神经元样细胞分化能力.
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大鼠脂肪基质细胞的分离培养及二步法诱导分化神经细胞
目的 研究脂肪基质细胞体外培养扩增及向神经细胞诱导分化的新方法.方法 取SD大鼠的腹膜后脂肪组织,以Ⅰ型胶原酶消化离心,含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞,增殖传代,取第5代细胞进行二步法诱导分化.首先以无血清Neurobasal培养基联合应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 20 ng/mL、表皮生长因子(EGF)20 ng/mL和N2(1:100)添加剂将细胞先诱导成神经球;再取第二代神经球加入1%胎牛血清、5%马血清、0.5μmol/L的维甲酸(RA)和50ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF),促进其向神经元和胶质细胞方向分化;免疫荧光染色鉴定细胞分化结果.结果 初接种的细胞大多呈圆球状,悬浮在培养基中,24 h后贴壁.随着细胞密度加大,形态变成单层成纤维样细胞,呈漩涡状排列.无血清Neurobasal培养基诱导5～7 d可见悬浮的神经球出现;神经球迅速增殖,14d时直径可达100μm.分化后的大部分细胞呈现典型的神经元样改变,细胞体为圆形,内可见明显的细胞核,细胞伸出细长突起或网状突起,可见较多的细胞形成网络连接.免疫荧光染色鉴定结果证实,除了神经球可以高表达巢蛋白(nestin)(阳性率75.62%±1.34%)之外,分化细胞还可有效表达β-mbulinⅢ(未成熟神经元标记物,阳性率达57.62%±4.92%)或微管相关蛋白2(MAP2ab)(成熟神经元标记物,阳性率11.25%±3.87%);有少量细胞表达胶质纤维酸性蛋白(GFAF)(阳性率18.34%±3.87%)和GalC(阳性率14.35%+3.98%).结论 从成年大鼠脂肪中分离得到的脂肪基质细胞可在体外培养得到大量分化潜能稳定的子代细胞.应用本实验二步诱导法,可得到较高比例的nestin及β-mbulinⅢ阳性细胞,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现.
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人脐带间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究
目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)的体外分离、纯化、扩增和向神经元样细胞的定向诱导分化,以期为脐带MSCs的神经移植提供理论依据.方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,酶消化法获取MSCs,进行培养.用流式细胞仪检测MSCs的表面标志.取扩增3,5,10代的MSCs分别向神经元样细胞诱导,用免疫组化和RT-PCR法检测神经元样细胞特异性标志.结果脐带富含MSCs,且脐带MSCs(UCMSCs)强表达CD13、29、CD44、CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33、CD45.神经条件培养基诱导后的细胞平均有70%左右呈现典型的神经元样表型.免疫组化法检测发现不同代数的MSCs经诱导后均表达nestin,NSE,NeuN,NF-M,弱表达GFAP.RT-PCR显示诱导后NSEmRNA表达增加.结论MSCs存在于人脐带中,并且在体外有较强的增殖能力,特定条件下能够分化为神经元样细胞.
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人脐血单个核细胞诱导分化为神经元样细胞
目的探讨人脐血单个核细胞体外向神经元样细胞定向诱导分化的条件.方法无菌条件下采集正常人脐血,分离单个核细胞.用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养.取扩增5代的间充质干细胞(MSC),分别用β-巯基乙醇(β-ME)、二甲基亚砜(DMSO)、神经条件培养液诱导脐血MSC向神经元样细胞分化.免疫组化法检测脐血MSC的Nestin表达和神经元样细胞特异性标志.结果脐血原代和2、5代MSC的Nestin表达阳性率分别为6.7%、12.4%和20.8%.神经条件培养液诱导神经元样细胞阳性率高达36%,β-ME、DMSO分别为33%和25%.结论脐血MSC具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化.
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人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化
目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性.方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养.检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能.结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞.结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性.
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缺氧后小鼠脑匀浆提取液对儿童MSCs分化为神经细胞的影响
目的:观察缺氧后不同时段小鼠脑匀浆提取液对儿童骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的影响,为筛选MSCs的佳移植时间提供依据.方法:制作缺氧小鼠模型;并制取缺氧不同时间段脑匀浆提取液;诱导儿童MSCs;比较MSCs分化为神经元样细胞的阳性率.结果:缺氧后1、4,7、10、13 d小鼠脑匀浆提取液均可将MSCs诱导成神经元样细胞,经免疫学鉴定NES染色强阳性;但各组阳性率不同,以缺氧10 d后阳性率(21.02±3.38)%高,与其他各组比较有统计学差异(P<0.05).结论:缺氧后小鼠脑匀浆提取液可诱导儿童MSCs分化为神经元样细胞,缺氧后10 d的分化率高.
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骨髓间充质干细胞诱导为神经元样细胞的研究进展
骨髓间充质干细胞(BMSCs)在一定条件下可诱导为神经元样细胞.本文就BMSCs体外诱导为神经元样细胞的研究进展作一综述.
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大鼠骨髓间质干细胞定向分化为神经元的实验研究
[目的]研究体外培养骨髓来源的表达nestin的成年大鼠骨髓间质干细胞(MSC)并诱导分化神经元样细胞的潜能,为中枢神经系统疾病的细胞移植治疗提供理想的供体.[方法]采用全骨髓法分离培养成年SD大鼠MSC,传至第6代的MSC接种在前一天涂有100 (u)g/L多聚赖氨酸的塑料培养瓶或培养皿中.用含100 mL/L FBS的DMEM/F12培养液添加10 ng/mL bFGF的培养液培养并以DMSO、BHA与Forskolin等诱导剂联合诱导MSC分化为神经元.流式细胞仪鉴定诱导前MSC的细胞表面抗原,免疫荧光检测诱导前及诱导后6 h、12 h、24 h神经元特异性抗原nestin、NF-200和GFAP表达率.[结果]流式细胞仪检测传至第6代MSC表面抗原CD29和CD44阳性率分为98.8%,96.6%.CD34和CD45阴性.免疫荧光鉴定传至第6代的MSC表达nestin阳性率为57.1%±6.9%,不表达NF-200和GFAP.诱导后30 min可见神经元样细胞出现.诱导后6 h、12 h、24 h经nestin和NF-200免疫荧光鉴定,诱导后6 h、12 h、24 h nestin阳性率分别为96.5%±1.9%.88.1%±5.4%,33.5%±5.4%,NF-200阳性率分别为90.1%±2.9%,97.5%±1.3%,98.1%±1.6%.[结论]骨髓来源的nestin阳性的MSC具有神经祖细胞特性并且可诱导分化为神经元样细胞,可作为种子细胞用于神经系统疾病的治疗.
