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抗脑衰胶囊含药血清诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用
目的：探讨抗脑衰胶囊对人脐带间充质干细胞（hUMSCs）向神经元样细胞分化的影响。方法通过贴壁法分离、培养、扩增脐带间充质干细胞，应用流式细胞仪检测其表面抗原表达。制备抗脑衰胶囊含药血清，诱导hUMSCs，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，应用免疫细胞化学方法观察诱导后神经细胞相关基因巢蛋白（ Nestin），神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达，并应用 RT-PCR 技术检测 NSE 表达。结果抗脑衰胶囊含药血清培养 hUMSCs后，Nestin、NSE 表达阳性，RT-PCR 检测结果显示，诱导后细胞表达 NSE。结论抗脑衰胶囊能促进 hUMSCs 向神经元样细胞分化，是较为理想的诱导剂。
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骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞前后基因方面及Ca2+浓度变化的研究
目的 观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)按照Woodbury经典诱导方案将其诱导分化为神经元样细胞前后基因方面及Ca2+浓度的变化.方法 分离纯化SD大鼠MSCs进行传代培养,传至第5代时,按照Woodbury经典诱导方案进行诱导,采用免疫组化和Realtime PCR技术检测诱导前后GAP-43、NSE、NF和Nestin 的蛋白和mRNA表达的变化,采用激光扫描共聚焦显微镜检测诱导前后细胞内游离钙离子浓度的变化.结果 诱导后GAP-43、NSE、NF和Nestin蛋白表达水平均有增高(P<0.05),但GAP-43、NSE、NF和Nestin基因表达改变不显著(P>0.05),更换诱导液后,细胞内荧光强度逐渐增加,到100s 达高峰值,其后逐渐减弱,但20 min 时细胞荧光强度仍高于诱导前.结论 MSCs诱导分化为神经元样细胞后GAP-43、NSE、NF和Nestin蛋白表达水平均有增高,但基因表达改变不显著,说明Woodbury经典诱导方案可能为转录后水平即蛋白水平的调控,游离钙离子可能对诱导分化有促进作用.
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金雀异黄素对骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞前后蛋白和Ca2+浓度变化的研究
目的 探讨不同浓度金雀异黄素对骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)按照Woodbury经典诱导方案将其诱导分化为神经元样细胞前后蛋白和细胞内游离Ca2+浓度的变化.方法 分离纯化SD大鼠MSCs进行传代培养,传至第5代时,待细胞融汇成致密单层后,加入不同浓度金雀异黄素(0、25、50、75和100 μmol/L)培养24 h后,按照Woodbury经典诱导方案进行诱导,采用免疫组化技术检测诱导前后GAP-43、NSE、NF和Nestin 的蛋白表达的变化,采用激光扫描共聚焦显微镜检测诱导前后细胞内游离钙离子浓度的变化.结果 随着金雀异黄素浓度的增加,诱导后各组GAP-43、NSE、NF和Nestin蛋白表达水平逐渐增高.更换诱导液后,各组细胞内荧光强度逐渐增加,到100 s达高峰值,其后逐渐减弱,但20 min 时细胞荧光强度仍高于诱导前,但是随着金雀异黄素浓度的增加,细胞内游离Ca2+浓度呈现浓度依赖性下降.结论 金雀异黄素能够促进MSCs诱导分化为神经元样细胞.游离Ca2+在诱导过程中可能不起关键性作用.
关键词： 骨髓间充质干细胞 神经元样细胞 免疫组化 激光扫描共聚焦显微镜 细胞内游离钙离子 -
不同功效中药诱导间充质干细胞定向分化的研究概况
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 具有分化成间质起源的任意组织的潜能,包括向神经元样细胞、软骨、脂肪、造血基质及骨等分化成熟的特征[1,2].
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骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中褪黑素受体和多效蛋白的表达
目的 体外诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化,并探讨分化过程中多效蛋白(PTN)和褪黑素(Mel)受体亚型MT1、MT2 mRNA的表达,以探索MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制.方法 密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs,原代和传代培养.取第6代MSCs设对照和实验组进行诱导,诱导后30 min至3 d,观察细胞形态并计数.免疫细胞化学法和RT-PCR法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和诱导前、诱导后12h PTN和MT1、MT2 mRNA的表达.结果 接种24 h后MSCs开始贴壁,呈圆形或椭圆形.3 d后可见梭状细胞呈集落状生长,10 d～14 d融合.第5代～第6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态.诱导后胞体向胞核收缩;出现双极及多极细胞.12 h变形细胞增多,细长突起相互连接.24 h后变形细胞增多不明显.诱导后12 h大部分细胞表达NSE、MAP-2,未检测到GFAP的表达.实验组诱导后12 h细胞有PTN和MT1mRNA的表达.结论 PTN和Mel信号传导可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化.
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不同传代倍数BMSCs向神经元样细胞分化后移植对认知功能障碍大鼠学习记忆能力的影响
目的 观察不同传代倍数骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化后移植对认知功能障碍大鼠学习记忆能力的影响.方法 全骨髓贴壁法分离、培养、扩增Wistar大鼠BMSCs.选取第3、4、5代BMSCs用bFGF(20 ng/mL)进行诱导48 h.自然衰老Wistar大鼠通过Morris 水迷宫筛选后随机分为4组,每组10只.对照组大鼠双侧海马注入生理盐水;3、4、5代细胞组大鼠分别注入向神经元样细胞诱导后的3、4、5代BMSCs.大鼠的学习记忆能力在移植前和实验后4周通过Morris水迷宫试验测定.结果 成功分离培养Wistar大鼠BMSCs,经诱导后大部分分化为神经元样细胞.与移植前相比,对照组大鼠学习记忆成绩下降(P>0.05);3、4、5代细胞组大鼠学习记忆成绩均有提高(P<0.05).与对照组相比,3、4、5代细胞组大鼠学习记忆成绩均有提高(P<0.05).3、4、5代细胞组间两两比较,差异均有显著性(P<0.05).结论 3、4、5代大鼠BMSCs向神经元样细胞分化后移植均可提高认知功能障碍大鼠的学习记忆能力,且4代细胞移植效果优于3代和5代.
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多效生长因子在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的表达变化
目的 探讨多效生长因子(PTN)在体外诱导成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化中过程不同时间的表达变化,了解多效生长因子是否参与BMSCs向神经元样细胞分化的机制.方法 以密度梯度离心加贴壁培养法分离成人BMSCs,进行原代和传代培养,以流式细胞仪鉴定纯度.对照组和实验组对传代第6代的BMSCs进行诱导分化,诱导后30 min至3 d,观察细胞形态并计数.将分化后细胞采用免疫细胞化学法测定神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达.对诱导前和诱导后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d细胞以RT-PCR法测定PTN mRNA表达.结果 BMSCs在接种1 d后黏附贴壁,呈椭圆形或圆形,3 d~5 d后呈梭状细胞成簇生长,7 d~12 d融合.传代至第5代~6代可见较为均一的成纤维细胞样形态.流式细胞仪检测结果显示:细胞表达CD44、CD105,不表达造血干细胞的特异标记CD45,证实其纯度.诱导后细胞胞体开始向细胞胞核收缩,出现双极或多极细胞.12 h变形细胞增多,细长突起相互连接.24 h后细胞变化不明显.诱导后细胞经免疫化学染色显示:多数表达NSE(64.79±0.06)%、MAP-2(60.05±0.09)%,而未检测到GFAP.实验组诱导后细胞不同时间点PTN mRNA的表达不同(P<0.01). 诱导后12 h~24 h PTN mRNA表达高.结论 建立成人BMSCs培养增殖体系基础上诱导BMSCs向神经元样细胞分化,诱导过程细胞有外观形态变化,同时表达神经细胞特异性标志物NSE和MAP-2.诱导后BMSCs与形态改变相似,向神经元样细胞分化的不同时间点,有PTN mRNA表达变化,提示PTN可能参与BMSCs向神经元样细胞的分化.
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体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的实验研究
目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(MSC),并诱导其向神经元细胞分化.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,并于体外扩增、培养,并通过诱导培养基进行体外诱导培养,比较对照组及实验组间细胞形态和神经丝蛋白(NFP)表达率的不同.结果:诱导后,实验组中80%的细胞表现出神经元样形态,且NFP阳性表达率明显高于对照组.结论:MSC在体外可以被诱导为神经元样细胞.
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右归丸含药血清诱导骨髓基质干细胞分化的佳浓度探索
目的:探讨右归丸含药血清体外诱导大鼠骨髓基质千细胞分化为神经元样细胞的佳浓度.方法:用DMEM/F-12培养液培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),采用不同浓度右归丸含药血清对其进行体外诱导,并用MTT法检测各组细胞生长情况,用免疫细胞荧光方法计算各组神经元样细胞阳性数加以比较.结果:BMSCs在2.5％含药血清培养液中活力好.结论:2.5％右归丸含药血清培养液是诱导BMSCs分化实验的佳浓度.
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三七总皂苷在骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的调解作用研究
目的:探讨三七总皂苷在骨髓间质干细胞( MSCs)分化为神经元样细胞中的调解作用.方法:①实验材料:成年健康Wister大鼠(雌雄不限),SRF级,体质量(150±30)g；②实验方法:无菌的条件下从大鼠的股骨中分离并继代培养MSCs细胞,当传至第5代时,先用完全培养液[含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]进行预诱导,再更换无血清培养液(含三七总皂苷0.25g/L)进行诱导,采用免疫组织化学SABC法检测神经丝蛋白(NF-M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP -2)、生长相关蛋白43( GAP-43)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表述.结果:①采用三七总皂苷诱导后,大多数MSCs呈神经元样细胞分化.经免疫组织化学鉴定,上述细胞表现为NSE、MAP-2和NF染色阳性,呈棕黄色,而GFAP染色阴性.②采用三七总皂苷进行诱导时,MSCs的胞体逐渐增大,并伸出细长的突起,在突起的末端出现分支,有些相邻细胞的突起还成网状连接,③三七总皂苷诱导MSCs转变为类似于神经元样的形态,经免疫组织化学鉴定,大多数细胞表现为NF -M、NSE、neslin、MAP -2和GAP -43染色阳性,并在胞质和突起中有棕黄色的物质,而GFAP染色均为阴性.SABC法显示NSE和MAP -2阳性细胞数分别为(72.64±2.04)％和(73.5±2.17)％.结论:三七总皂苷在体外能使MSCs向神经元样细胞转化,且具有神经元样细胞的特性,这为MSCs治疗相关疾病提供了理论基础.
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碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA体外定向培养骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化
背景:采用中药作为诱导剂对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化是否会有效果呢?目的:验证碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入中药丹参酮ⅡA 体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的效应.方法:采用Percoll 分离液密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞,取第3 代细胞利用碱性成纤维细胞生长因子联合丹参酮ⅡA 诱导其向神经元样细胞分化,全反式维甲酸无血清培养基诱导液及不进行诱导的细胞做为对照.结果与结论:①骨髓间充质干细胞能稳定表达间质细胞特异性的标记物CD44,表达阳性率为(91.00±1.58)%,但不表达CD34 、CD45,流式细胞学检测其纯度高达95.5%.②诱导分化后经扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫组织化学检测细胞表达神经元特导性烯醇化酶,神经元特导性烯醇化酶阳性率为(75.60±2.31)%,Nestin 呈一过性表达增加后随着诱导时间延长逐渐减低至阴性,不表达神经胶质纤维酸性蛋白.说明经碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA 能高效地定向诱导神经元样细胞的分化.
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人脐血间质干细胞向神经元样细胞分化的诱导因素
背景:研究证明脐血间质干细胞可向神经元样细胞分化,要同时保证脐血间质干细胞的扩增能力与分化潜能.其培养和诱导分化条件的优化显得尤为重要.目的:分析筛选人脐血间质干细胞向神经元样细胞体外诱导分化过程的影响因素.设计、时间及地点:随机对照实验,于2006-08/2007-05在河南省红十字血液中心血液成分应用研究所完成.材料:脐血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的胎儿,平均采血量95mL.重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司:分离细胞所用的四联袋为山东威高集团公司产品.方法:取采集6h内的脐血,采用四联袋密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,以5×109L-1接种于DMEM/F12培养基中.[1]细胞因子实验:单独细胞因子组加入20μg/L B27、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子:细胞因子联合组在此基础上加入5μg/L重组人表皮生长因子.[2]红细胞混入量实验:裂解组加入红细胞裂解液1mL,裂解后红细胞混入量为(0.44+±0.13)×108/份:少红细胞组红细胞混入量为(0.51±0.21)×108/份,多红细胞组红细胞混入量为(2.65±1.28)×108/份.[3]首次换液时间实验:分别于接种后48h、7d首次换液.[4]诱导分化:将碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子共诱导7d的细胞爬片进行巢蛋白免疫组织化学染色.主要观察指标:观察不同因素对脐血间质干细胞增殖分化的影响.检测诱导分化后神经干细胞巢蛋白的表达.结果:培养7d后,表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合诱导促细胞增殖的效果优于单独应用碱性成纤维细胞生长因子(t=2.880,P<0.05);红细胞裂解液组、多红细胞组贴壁细胞数明显低于少红细胞组(t=7.332～7.550,P<0.05),即混入的红细胞总量不大于108/份对细胞增殖无影响:接种后7d首次换液所获贴壁细胞数明显多于接种后48h首次换液(P<0.05).两种细胞因子共诱导后,神经干细胞巢蛋白呈阳性表达.结论:在脐血间质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中,细胞因子、红细胞混入量及首次换液时间都是重要的影响因素.
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体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化
背景:研究表明,移植后的骨髓间充质干细胞在新的环境中能够被诱导分化为神经元样细胞,从而替代损伤细胞重建神经环路.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞和神经细胞的体外共培养系统,观察共培养条件下神经细胞对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响.方法:体外培养Wistar大鼠脑组织神经细胞和股骨骨髓间充质干细胞,采用Transwell小室共培养分化诱导,观察骨髓间充质干细胞的组织形态变化,在共培养第5天免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞中神经细胞的特异标志物;与对照组单纯骨髓间充质干细胞培养结果相比较.结果与结论:神经细胞共培养系统中的骨髓间充质干细胞生长伸展,呈放射状,互相形成连接,特异性烯醇化酶显示阳性结果,具有神经元样细胞的特性,表达特异性烯醇化酶阳性的神经元比例可达(33.0±10.5)%.而对照组骨髓间充质干细胞未形成神经元样细胞的形态结构,免疫荧光显示特异性烯醇化酶阴性.提示神经细胞提供的微环境对骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞具有诱导分化作用.
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川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞:佳诱导剂量筛选
背景:目前用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导剂众多,但多数化学诱导剂具有毒性不适合用于人体.目的:观察中药川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找川芎嗪诱导分化的佳浓度.方法:SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,1.25,1.50 g/L 3种剂量盐酸川芎嗪注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导.倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较3种剂量盐酸川芎嗪注射液诱导神经元样细胞抗原表达率.结果与结论:①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列.②第5代骨髓间充质干细胞(98.02±0.81)%CD44表达阳性,CD45表达阴性.③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,1.25 g/L浓度组细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性表达率高.提示川芎嗪可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,1.25 g/L为适诱导剂量.
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丹参诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达
背景:骨髓间充质干细胞在适当的诱导条件下,可在体内外分化为神经细胞与神经前体细胞,但多数研究多以含血清及细胞因子的培养基为诱导剂.目的:以丹参作为诱导剂,观察骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达,拟寻找新的诱导方法.设计:以细胞为观察对象的重复观察测量,对照性体外实验.单位:四川大学基础与法医学院人体解剖教研室.材料:实验于2004-10/2005-12在四川大学基础与法医学院人体解剖教研室完成.为四川省重点实验室.SD大鼠,体质量150～200 g,由本校动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.丹参注射液由安徽天洋药业有限公司提供,批号20050411.方法:采用密度梯度离心和细胞贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第5代细胞进行诱导.用丹参注射液诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,对照组以不含丹参注射液的无血清培养液进行培养.采用RT-PCR检测诱导前后细胞ngn-1,mash-1的表达,免疫组织化学检测诱导前后的骨髓间充质干细胞NSE和GFAP的表达.主要观察指标:①RT-PCR检测细胞诱导前后ngn-1,mash-1的表达.②免疫组织化学检测诱导前后的骨髓间充质干细胞NSE和GFAP的表达.结果:①骨髓间充质干细胞贴壁生长情况良好,大部分细胞贴壁呈长梭形.加入诱导剂后,细胞体秘缩小,部分细胞有突起,形状类似神经元.②RT-PCR反应检测显示,未经诱导的骨髓间充质干细胞ngn-1,mash-1mRNA为阴性,诱导后呈阳性表达.③细胞免疫组织化学检测显示,诱导后的细胞NSE和GFAP呈阳性反应,对照组为阴性.结论:丹参注射液能够诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.
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复合诱导液诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化
目的:目前对脂肪基质细胞向神经元样细胞分化基本采用人工合成的化学诱导剂的方法进行诱导,其中部分组合试剂费用昂贵,不适合进行大规模基础和临床实验.因此以复合诱导液作替代,观察其能否在体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞方向分化.方法:实验于2004-10/2005-06在华北煤炭医学院中学实验室完成.①实验材料:腹部皮下的脂肪组织来源于30例自愿捐献者,年龄20～35岁,通过外科手术获得.复合诱导液的组成:alpha-MEM+BHA(200 μmol/L)+KCI(5 mmol/L)+丙戊酸钠(2 μmol/L)+IBMX(0.5 mmol/L)+氢化可的松(1 μmol/L)+胰岛素(5 mg/L)+乙醇(0.5%)+青霉素(100 U/mL)+链霉素(100 mg/L).②实验方法:离体的脂肪组织消化、离心、过滤,进行人脂肪基质细胞的原代培养.按8×103/cm2接种,消化传代.取第3代人脂肪基质细胞,接种到孔中预先放置无菌盖玻片的24孔培养板,细胞生长达50%～60%融合时,去除培养液,换为复合诱导液进行诱导;空白对照组培养液为DMEM/F12培养基.③实验评估:自加入诱导剂后在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态变化,应用免疫细胞化学方法检测神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白、神经细胞的特异性标志神经元特异性烯醇化酶及微管联合蛋白2、神经胶质细胞的特异性标志胶质纤维酸性蛋白的表达.结果:①体外培养过程人脂肪基质细胞的形态学观察:刚分离接种的细胞呈圆形,悬浮状态.接种24 h内细胞大多已贴壁,呈梭形、圆形或多角形,有粗大突起,核居中,1～2个核仁.48 h后贴壁细胞开始分裂增殖,多呈梭形.1周后细胞融合成单层,排列出现方向性,但有少量圆形及卵圆形细胞混杂生长.②复合诱导液诱导脂肪基质细胞向神经元样细胞分化的形态学观察:人脂肪基质细胞胞体回缩,呈圆形或锥形,胞体周围具有较强的光晕,胞体有突起伸展,具有典型的神经细胞样形态.空白对照组形态无变化.③免疫细胞化学检测神经元样细胞的特异性标志的表达:诱导5 h后,人脂肪基质细胞神经巢蛋白阳性表达率为(21.8±2.6)%,神经元特异性烯醇化酶为(36.8±3.3)%,微管联合蛋白2为(92.0±10.5)%,胶质纤维酸性蛋白为(96.0±5.6)%.空白对照组细胞以上各指标表达均呈阴性.结论:复合诱导液可替代费用昂贵的人工合成的化学诱导剂,在体外成功诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化.
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依达拉奉体外定向诱导人间充质干细胞向神经元样细胞的分化
背景:依达拉奉作为新型氧自由基清除剂,一般用于抑制脂质过氧化反应,减轻脑水肿,保护神经细胞.目的:观察依达拉奉体外定向诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2007-12/2008-09广东医学院附属医院中心实验室完成.材料;骨髓来源于创伤所致闭合性股骨骨折的成年患者.由广东医学院附属医院骨科提供.依达拉奉由南京先声药业生产,批号P2007123144254453.方法:无菌抽取的骨髓经肝素化后,采用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离获得人骨髓间充质干细胞,传至第5代按1×108L-1接种于6孔板内,设立2组,依达拉奉组细胞达50%融合时用含碱性成纤维生长因子、胎生血清的L-DMEM预诱导24 h,PBS洗涤后再用20 mg/L依达拉奉无血清L-DMEM诱导24 h;空白对照组始终用含体积分数为10%胎生血清的L-DMEM培养,不加任何预诱导剂和诱导剂.主要观察指标:诱导分化后细胞形态变化,SP法免疫细胞化学鉴定神经元烯醇化酶、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白2的表达.结果:体外诱导1h后,依达拉奉组胞体收缩,2h后形成较长突起,5h后呈典型神经元样细胞;空白对照组细胞仍呈对称的梭形,无突起形成.免疫组化结果显示,诱导6 h后依达拉奉组神经元样细胞的胞体及部分突起呈棕黄色,强表达神经元烯醇化酶,弱表达胶质纤维酸性蛋白和巢蛋白,不表达微管相关蛋白2:空白对照组上述4种特异性抗原均呈阴性表达.结论:人骨髓间充质干细胞经依达拉奉体外诱导后,所分化的细胞具有神经元表型,但还不够成熟,处于向成熟神经元分化的中间阶段.
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红景天苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞
背景:前期实验证明红景天苷能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,但是具体的影响方式尚不清楚.目的:以骨髓间充质干细胞为研究对象,进一步探讨红景天苷诱导其向神经元样细胞定向分化的作用方式和分子机制.方法:选取第2代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,按照不同的诱导剂分为维甲酸诱导组、红景天苷诱导组和对照组,通过不同的时间点对细胞进行观察.结果与结论:两诱导组细胞不同时间点神经干细胞标志物巢蛋白、神经细胞分化相关的兔抗微管蛋白和神经微管相关蛋白2表达阳性率均高于对照组(P < 0.01);神经胶质纤维酸性蛋白阳性率维甲酸组显著高于红景天苷组(P < 0.01).Real Time-PCR结果显示,维甲酸和红景天苷诱导不同时间,两组细胞均有神经细胞相关基因神经元特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2 mRNA表达,与诱导时间有关且不完全相同,两组间神经胶质纤维酸性蛋白mRNA的高丰度出现于诱导早期;诱导后两组神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达随时间延长显著增加,兔抗微管蛋白表达出现于诱导早期.说明红景天苷能促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,其诱导效应与维甲酸相似,且向神经元样细胞定向分化方面优于维甲酸.
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体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化:Wnt3a信号分子的诱导作用
背景:Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节.已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控.目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道.目的:寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子.方法:采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养.传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞.采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案,通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用,以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照.结果与结论:间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,形态均一,呈长梭形,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD34、CD45低表达.Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性,胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好;Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达,神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性.RT-PCR结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显;胶质纤维酸性蛋白在诱导10d后有比较弱的扩增条带出现.结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化.
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碘对骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞存活时间的影响
背景:体外实验中人们发现,常规化学诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞存活时间较短,这就限制了其进一步的应用.关于碘是否可以延长诱导的神经元样细胞的存活时间尚未见系统报道.目的:观察微量兀索碘对由骨髓间充质干细胞分化成的神经元样细胞存活时间的影响.方法:无菌条件下取大鼠第3代间充质干细胞,分为A～F组:A组不加碘离子,B～F组中分别加入质量浓度为2,55,90,125和2 500 mg/L的碘离子,另设空白对照组,同时加化学诱导剂二甲基亚砜向神经元方向诱导分化.对诱导后的细胞进行免疫组织化学检测,观察诱导的神经元样细胞在不同质量浓度碘离子下的存活时间.结果与结论:加入的碘离子质量浓度在55～125 mg/L时,细胞存活时间可达到5 d,镜下细胞结构完整,5 d后随培养时间的延长,死亡细胞逐渐增多,至1周左右,神经元样细胞几乎全部死亡.碘离子质量浓度为2 mg/L和2 500 mg/L时,细胞存活时间为12～36 h,和未加碘离子组差异无显著性意义,至两三天,神经元样细胞几乎全部死亡.提示适当浓度的碘离子加入到常规化学诱导剂中,可延长骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞的存活时间;加入到化学诱导剂中的碘离子质量浓度过低或过高时,不改变骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞的存活时间.
