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骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞迁移能力变化的研究
目的 研究体外定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞的方法,探讨其分化后迁移能力变化的分子机制.方法 体外培养BMSCs,以β-巯基乙醇(BME)1 mmol·L-1诱导分化,于诱导后12 h、24 h分别观察细胞形态变化,RT-PCR鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、神经丝蛋白(Neurofilament) 、胶质纤维酸性蛋白(β-tubulin Ⅲ) mRNA的变化.Western blot检测CXCR4表达变化,细胞迁移实验检测BMSCs诱导前后迁移能力的变化.结果 诱导后,BMSCs胞体收缩,突起伸出;RT-PCR发现诱导出的神经元样细胞的NSE、Neurofilament 、β-tubulin Ⅲ mRNA明显增加;Western blot结果表明神经元样细胞表面CXCR4的表达明显增加,细胞迁移实验发现神经元样细胞向SDF-1α的迁移能力明显增加.用CXCR4特异的抑制剂AMD3100处理后细胞迁移被明显抑制.结论 在体外骨髓基质干细胞以BME为诱导剂可定向分化为神经元样细胞,且发现其迁移能力明显增加,其机制可能与其表面CXCR4表达上调有关.
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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究方案
近年来神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植治疗神经系统疾病成为研究热点之一,但NSCs的来源困难,并且存在伦理学争议,这在很大程度上限制了干细胞移植应用的发展.研究发现骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)在细胞因子、化学试剂、共培养、药物诱导下具有向神经元样细胞(Neural-Like Cells)分化的能力,因而成为干细胞的主要来源.本文就近年BMSCs体外诱导分化为神经元样细胞的研究方案作一综述.
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骨髓间充质干细胞移植修复缺血性脑损伤
近年来关于成体间充质干细胞特性的发现是对公认生物学概念的挑战.首先是在描述来自骨髓的成体间充质干细胞在特殊化学剂诱导下分化为神经元样细胞后,诸多学者开始研究运用这一发现治疗缺血性脑血管疾病的可能性.
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共培养条件下骨髓基质细胞与嗅鞘细胞的相互作用
[目的]研究骨髓基质细胞与嗅鞘细胞共培养条件下,两种细胞之间的相互作用,为进一步行细胞联合体内移植提供理论基础.[方法]取大鼠骨髓基质细胞和嗅鞘细胞进行分离培养纯化及鉴定,将纯化后的骨髓基质细胞和嗅鞘细胞共培养,对共培养细胞进行形态学观察,检测间充质干细胞标记物Vimentin、NGF受体标记物P75、神经干细胞标记物Nestin.[结果]共培养部分细胞形态上具有神经细胞特征;经免疫荧光观察一部分细胞呈p75阳性,另一部分细胞呈Vimentin阳性,它们呈条索状包绕p75阳性细胞,细胞簇中央的细胞呈Nestin阳性.[结论]骨髓基质细胞和嗅鞘细胞能在体外共同存活、生长,且通过细胞的相互作用,能激活BMSCs向神经元样细胞分化的潜力,提示借助于细胞间的相互作用,采取恰当的细胞联合移植干预有可能弥补单一细胞类型自身的不足,这为BMSCs和OECs体内联合移植的可行性提供了理论依据.
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人脐血干细胞培养及其向神经元样细胞定向诱导分化的研究
目的:通过体外培养脐血干细胞并诱导分化为神经元样细胞,为研究脐血干细胞移植修复脊髓损伤奠定基础.方法:用密度梯度离心法将脐血单个核细胞从脐血中分离出来,置于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养、扩增、传代,取体外扩增5代的脐血间充质干细胞(MSCs),接种于培养板内,将诱导剂3-叔丁基4-羟基茴香醚(BHA)和二甲基亚砜(DMSO)加入条件培养基静置培养,观察细胞的形态学和组织学变化,取神经元样细胞进行免疫组化检测细胞表面标志物神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP),然后,在光镜下随机数取10个非重叠视野(×100),计算NSE、NF及GFAP阳性细胞占总细胞数的比例,实验结果用统计学分析.结果:光镜下hMSC在预诱导液中处理24h后,加入诱导液,1 h后细胞形态发生变化,原来宽大扁平的hMSCs胞质向核收缩,胞体向胞核收缩成锥形且变得致密并有折光性,有较多的长突起,6 h后多数细胞均转变为类似于神经元的形态,3 d后免疫组化检测NSE、NF及GFAP的阳性率分别为(35.24±3.63)%、(33.46±3.21)%、(15.12±1.65)%.结论:脐血MSC在体外有较强的扩增能力,并且在一定条件下可以诱导成为神经元样细胞.
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大鼠胎血间充质干细胞的体外扩增及诱导分化为神经元样细胞的研究
目的:研究大鼠胎血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分离、扩增及向神经元样细胞分化的可能性,为进一步的动物实验研究打下基础.方法:无菌条件下采集15只孕20d大鼠的胎血,Ficoll-hypague分离液分离出单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)后,置于含10%胎牛血清的DMEM/LG培养传代.细胞化学染色法检测MSCs的细胞化学特征,流式细胞仪检测其免疫表型.取扩增第5代的MSCs向神经元样细胞定向诱导,免疫细胞化学法鉴定其特异性标志.结果:大鼠胎血MSCs可大量扩增,细胞化学染色示其α-丁酸萘酚酯酶(NBE)阳性,碱性磷酸酶(ALP)阴性,流式细胞仪检测显示其表达CD44、CDs4,不表达CD11b、CD45.诱导后MSCs形态学观察类似于神经元,免疫细胞化学检测发现其巢蛋白(Nestin)和特异性烯醇化酶(NSE)阳性,胶原纤维酸性蛋白(GFAP)阴性.结论:大鼠胎血能够分离、扩增培养出MSCs,在适当条件下可向神经元样细胞定向诱导分化,大鼠胎血可作为MSCs的来源进一步做动物实验.
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骨髓间充质干细胞体内定向分化为神经元样细胞的研究
虽然骨髓MSC具有广阔的应用前景,但是还有许多问题没有解决.进一步探索决定其分化的关键基因,发现影响其向其他谱系细胞分化的细胞、免疫、分子学机制,找到调控移植细胞迁移和整和的方法等,是在真正临床应用之前所必须要做的工作
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人脐血间充质干细胞体外向神经元样细胞分化的实验研究
目的:探讨来源于人脐带血的间充质干细胞体外诱导分化成神经元样细胞的可行性.方法:采用密度梯度离心方法分离人脐带血单个核细胞,用MesenCult培养液体外扩增生长传代培养,于倒置显微镜下观察其生长特性.取第3代的脐血间充质干细胞,用10μg/L成纤维细胞生长因子和30μmol/L全反式维甲酸诱导培养的细胞向神经细胞分化.倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于诱导前、诱导后5 d和10 d分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色.结果:培养3代的脐血间充质干细胞经全反式维甲酸和成纤维细胞生长因子诱导后发生形态改变,呈双极或多极的神经元样形态,诱导5 d时神经元特异性烯醇化酶表达率为(30.3±5.2)%,而诱导10 d时达到(53.9±6.5)%,二者差异有统计学意义(P＜0.05).不表达胶质纤维酸性蛋白.结论:脐血间充质干细胞经成纤维细胞生长因子和全反式维甲酸体外诱导,能够分化为神经元样细胞.
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定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞及神经元样细胞的研究
维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.结果 倒置显微镜下观察到分离培养的骨髓间充质干细胞大小均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多.MSCs传至第3代采用流式细胞仪检测CD71、CD29呈阳性表达;经油红O染色证实,第5代MSCs经诱导后分化为脂肪细胞;而免疫细胞化学证实MSCs经诱导后分化为神经元样细胞,表达NSE、Nestin,不表达GFAP在体外,大鼠MSCs可诱导分化为脂肪细胞、神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能,是组织工程研究中有前途的种子细胞之一.
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骨髓间充质干细胞移植治疗视网膜病变
目前,对视网膜病变的治疗仍缺乏有效的药物.为解决视网膜损伤的修复问题,有研究者用胚胎干细胞、胚胎视网膜祖细胞、成体哺乳动物眼干细胞等进行了实验,但这些方法都存在着伦理学和移植学上的不足.骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)是骨髓中一类具有多向分化潜能的细胞群,在体外可诱导分化为神经元样细胞,进行BMSC移植,为视网膜病变的治疗提供了一条新的途径.现就BMSC生物学特征、体外的分离和纯化、向神经元样细胞的诱导分化及在视网膜病变治疗中的研究进展作一综述.
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人羊膜来源间质干细胞的分离、培养及鉴定
目的:探讨来源于人羊膜间质干细胞(amniotic-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)的分离、培养及鉴定.方法:无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片,加入胰酶37℃消化30 min,共2次,然后加入终浓度1.0 g/L的胶原酶和0.1g/L的DNA酶,37℃消化60 min,收集细胞,用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基进行培养和纯化.倒置显微镜观察细胞形态,取4～6代的细胞用流式细胞仪分析细胞表面标志,取扩增第3代后的AD-MSCs加入全反式维甲酸(RTRA)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)向神经元样细胞诱导分化.结果:来源于羊膜的细胞种植于DMEM/F12培养基中后,可在体外大量扩增并纯化;流式细胞检测显示:CD29、CD44、HLA-ABC阳性表达,CD34、CD45、HLA-DR阴性表达.免疫细胞化学显示AD-MSCs经RTRA和bFGF诱导后表达神经元特异性烯醇化酶,不表达胶质纤维性蛋白.结论:羊膜中存在间质干细胞,其可以在体外培养、扩增、纯化,并可在体外向神经元样细胞分化.
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小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究
目的:探讨体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞(mouse marrow mesenchymal stem cells,mMSCs)分化为神经元样细胞的条件.方法:密度梯度离心结合差异贴壁法分离、纯化mMSCs,胰蛋白酶消化传代扩增mMSCs.用适浓度的β-疏基乙醇(BME)+神经生长因子(NGF)、NGF+全反式维甲酸(ATRA)、NGF+BME+ATRA作为诱导剂,观察诱导期间细胞的形态变化,并用免疫细胞化学法鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)的表达,行甲苯胺蓝染色显示尼氏小体.结果:(1)免疫细胞化学显示NGF+BME+ATRA诱导组诱导效率高,78%细胞表达NSE,80%细胞表达NF;(2)各诱导组尼氏染色均出现尼氏小体.结论:NGF、BME、ATRA能诱导mMSCs分化为神经元样细胞,其中以NGF(10μg/L)+BME(2.5mM/L)+ATRA(2.5M/L)组效率高.
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大鼠胎血与骨髓间充质干细胞分化能力的体外研究
目的:比较大鼠胎血和骨髓中间充质干细胞(MSC)体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同.方法:采用标准Ficoll-hypague技术分离大鼠胎血和骨髓的单个核细胞(MNC),收获MSC传代培养,流式细胞仪检测细胞的免疫表型.β-巯基乙醇、二甲基亚砜、叔丁基对羟基茴香醚诱导MSC向神经元分化,免疫细胞化学法检测其特异性标志巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:2种MSC细胞形态、免疫表型无明显差异.定向诱导后,2种细胞均表达Nestin、NSE,但GFAP阴性.结论:大鼠胎血和骨髓MSC的细胞形态、生物学特性无明显差别;两者诱导分化为神经元样细胞的能力无显著差异.胎血应是MSC的又一来源.
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不同方法诱导脂肪干细胞向神经元样细胞分化研究
目的 通过比较化学和生长因子两种不同诱导方法,观察评估脂肪干细胞(ADSCs)向神经元样细胞(NLCs)分化,并探讨诱导分化机制.方法 取SD大鼠腹股沟和腹膜后脂肪分离培养获得ADSCs,取其第3代细胞进行流式细胞表型鉴定(CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105)并进行实验诱导.分为化学诱导组[DMEM/F12 +5 mmol/L β-巯基乙醇(β-BME)+2％二甲基亚砜(DMSO)+ 200 μmol/L丁酸酯羟基茴香醚(BHA)]和生长因子分步诱导组[第1步:DMEM/F12+20 μg/L表皮生长因子(EGF)+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) +2％ B27;第2步:DMEM/F12+ 10 μg/L脑源性神经营养因子(BDNF)+ 10 μg/L胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)+1 μmol/L维甲酸(RA)].每天在光镜下观察其形态变化,并在第3天用免疫荧光法检测诱导后神经细胞特异标志物巢蛋白(Nestin)、神经元核蛋白(NeuN)、抗微管相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,并行统计学分析.结果 流式细胞仪检测结果显示,第3代ADSCs细胞表型CD34(0.57％)、CD45(0.67％)、CD29(99.38％)、CD90(96.21％)、CD73(99.80％)和CD105(97.97％).化学诱导组在诱导24 h后即出现神经元样细胞形态,表达Nestin和MAP-2,但其诱导后形态在第5天出现逆转且在第7天有部分细胞开始死亡;生长因子诱导组诱导3d时Nestin表达,1周后MAP-2、Neun和GFAP表达逐渐增加,诱导生成稳定NLCs.结论 化学诱导ADSCs向神经元样细胞分化速度较快,但其性质不够稳定,形态出现逆转且伴随细胞死亡;生长因子法能够实现稳步诱导,诱导生成的NLCs更符合组织工程种子细胞的要求.
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戊四氮及NF-κB圈套结构对神经元样细胞GAP-43表达的影响
目的:观测戊四氮(PTZ)及NF-κB圈套寡核苷酸结构对神经元样PC12细胞生长相关蛋白-43(GAP-43)表达的影响.方法:应用免疫印迹检测PTZ干预前后神经元样PC12细胞GAP-43的表达情况,进而运用基因转染技术将NF-κB圈套寡核苷酸转入神经元样PC12细胞中,应用激光共聚焦成像技术(CLSM)检测转染前后NF-κB的活性变化,免疫印迹观察转染前后GAP-43的变化情况.结果:①PTZ干预后神经元样PC12细胞GAP-43的表达显著增高;②CLSM检测显示转染NF-κB圈套寡核苷酸后神经元样PC12细胞中NF-κB活性明显下降,但GAP-43表达水平未降低.结论:PTZ可促进GAP-43的表达,NF-κB对GAP-43的表达不具有调控作用.
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脂肪基质细胞向神经元样细胞诱导分化的研究现状
来源于中胚层脂肪组织中的脂肪基质细胞(ADSC)具有自我修复和多向分化能力.β-琉基乙醇、丁基羟基茴香醚等化学试剂和表皮生长因子(EGF)等细胞生长因子均能诱导ADSC向神经元样细胞分化,ADSC源性神经元样细胞相关研究为神经系统疾病的治疗开辟了新思路.本文将对ASDC生物学特性、神经分化、诱导后细胞功能的研究以及体内应用情况现状进行总结,并对研究前景进行展望.
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骨髓基质细胞分离培养、体外向神经细胞诱导分化及其在中枢神经系统疾病中的研究进展
细胞替代治疗为神经系统疾病的治疗提供了新的治疗途径.骨髓中存在着非造血干细胞--骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)[1],被认为是细胞替代治疗的理想种子细胞.目前存在大量体外将BMSCs向神经元样细胞定向诱导分化的研究.现将BMSCs分离培养、体外向神经细胞诱导分化情况及其在中枢神经系统疾病中的研究进展作一综述.
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脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞初步观察
目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)转染人脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因后在体外分化为神经元样细胞的功能.方法 克隆人BDNF基因并构建其真核表达载体;分离培养5只豚鼠BMSCs,观测其形态并用流式细胞仪鉴定;将人BDNF基因电穿孔法转染BMSCs,G418筛选后用维甲酸诱导分化,免疫细胞化学法对分化细胞进行鉴定.结果 分离培养的细胞具有典型的BMSCs形态和标志,转染诱导后的细胞表达神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白(Nestin)和胶质纤维酸性蛋白,并能分泌BDNF.结论 BDNF基因转染的BMSCs在体外能分化为神经元样细胞,电穿孔法能提高转染率,RA有促诱导作用.
关键词： 脑源性神经营养因子基因 骨髓间充质干细胞 诱导分化 神经元样细胞 -
清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞
目的 观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞.方法 通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流武细胞仪检测细胞表面抗原的表达.用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞.结论 清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞.
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慢性粒细胞性白血病患者间充质干细胞的分离、纯化及向神经元样细胞分化的研究
目的研究慢性粒细胞性白血病(CML)骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、纯化、扩增以及在体外向神经元样细胞定向分化的能力.方法获取CML患者的骨髓MSCs,采用低血清培养液培养,瑞士染色观察其形态;流式细胞仪检测其免疫表型和细胞周期;逆转录-聚合酶链反应(R-PCR)检测CML特异性表达的bcr/abl基因;分析骨髓MSCs染色体核型.全反式维甲酸(ATRA)诱导MSCs在体外分化为神经元样细胞,倒置相差显微镜观察神经元样细胞的形态,免疫组织化学染色法和Western blot法检测神经丝蛋白(NF)和神经元烯醇化酶(NSE)的表达.结果CML来源的骨髓MSCs呈纤维样贴壁生长,体外培养易扩增;表达相关抗原CD29、CD44、CD105,不表达CD31、CD13、CD34、CD45、HLA-DR;不表达bcr/abl融合基因,且具有正常的核型;不同扩增代数的MSCs在诱导剂的作用下呈现典型的神经元样细胞形态,NF、NSE呈阳性反应.结论CML患者骨髓中可以分离培养MSCs,它具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性和定向分化为神经元样细胞的能力,是一种可用于神经系统疾病治疗的种子细胞.
