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初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞中的作用
目的:研究初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法:全骨髓贴壁法分离、培养、纯化MSCs.含15 μmol/L白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫印迹检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.免疫荧光法检测MSCs增殖情况.扫描电子显微镜检测MSCs表面初级纤毛,免疫荧光法检测初级纤毛蛋白(Ac-Tu)的表达.结果:白藜芦醇诱导后60％的细胞胞体收缩,立体感增强,类似神经元.免疫印迹显示MSCs及对照组细胞有NSE蛋白的轻度表达,诱导后NSE、MAP-2蛋白表达阳性,随着诱导时间延长,NSE、MAP-2的表达渐增强.经过24 h饥饿后,90％的MSCs处于生长静止状态.扫描电子显微镜及免疫荧光显示,处于生长静止期的MSCs具有初级纤毛,且白藜芦醇可诱导具有初级纤毛的MSCs分化为神经元样细胞.对照组则无明显变化.结论:白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞.在此过程中,初级纤毛可能发挥着重要作用.
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大鼠骨髓间充质干细胞在海马神经元培养基中的定向分化
目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在大鼠海马神经元条件培养液中向神经元的分化.方法:以回收的海马神经元Neurobasal加B27作为条件培养基,DMEM加bFGF作为无血清培养基,普通Neurobasal加B27作为神经元基础培养基分别诱导第5代BMSCs 12 h和24 h;免疫细胞化学显色方法鉴定各组神经元样细胞,计数和比较各组阳性细胞阳性率.结果:经海马神经元条件培养基诱导,大鼠BMSCs能够分化为神经元样细胞,免疫细胞化学显色呈微管相关蛋白-Ⅱ(MAP-Ⅱ)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性;且阳性比例明显高于其他实验组,差异有统计学意义.结论:BMSCs在海马神经元条件培养基中可以分化为神经元样细胞,其分化效果优于传统DMEM加bFGF无血清培养基和神经元基础培养基.
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白血病抑制因子及神经生长因子联合诱导大鼠肌源性干细胞向神经元样细胞分化
目的:探讨白血病抑制因子(LIF)和神经生长因子(NGF)联合诱导大鼠肌源性干细胞分化为神经细胞的可能性和条件.方法:从大鼠乳鼠骨骼肌中分离培养肌源性干细胞,LIF和NGF进行分化诱导,以MEM培养基同等条件培养作对照,相差显微镜下观察细胞形态变化.免疫组织化学显色观察神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,测定细胞转化率.结果:肌源性干细胞经过LIF和NGF诱导12 h后,部分细胞分化,类似神经细胞;免疫组织化学显色观察神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白呈强阳性.结论:LIF和NGF联合应用能将肌源性干细胞诱导成神经元样细胞,为细胞移植治疗脊髓损伤提供一种高效种子细胞生产方法.
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共培养条件下大脑皮层神经元诱导肌源性干细胞成神经元样细胞
目的:研究使用共培养系统将肌源性干细胞(MDSCs)诱导为神经元样细胞的可行性及机制.方法:分离新生SD大鼠的MDSCs及皮层神经元,以叔丁基过氧化氢(终浓度为200μmol/L)损伤神经元,构建氧化应激损伤的神经元模型.当MDSCs差速贴壁至第5代时,将其随机分为MDSCs和损伤的神经元置于共培养系统中培养(损伤组)、MDSCs和正常神经元共培养(未损伤组)以及MDSCs置于共培养系统中单独培养(MDSCs组),培养7d后用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学法鉴定诱导的结果,并用大鼠脑源性神经营养因子(BDNF) ELISA试剂盒检测不同时间点各组培养液中该因子的分泌情况.结果:共培养7d后检测到损伤组与未损伤组均有部分MDSCs分化为表达NSE的神经元样细胞,前者分化率高于后者,MDSCs组未见有细胞分化为神经元样细胞.第2天损伤组BDNF的分泌量高于未损伤组,同时,损伤组第2天BDNF的分泌量高于第4天和第6天的分泌量.在不同时间点损伤组与未损伤组培养液中BDNF的分泌量均高于MDSCs组.结论:在共培养条件下,大鼠皮层神经元可诱导MDSCs为神经元样细胞,这与神经元分泌的BDNF有着重要联系,MDSCs也可分泌BDNF.
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人骨髓间质干细胞的分离培养和诱导分化为神经元样细胞的研究
目的:探索成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及诱导分化为神经元样细胞的体外条件.方法:采用Ficoll淋巴细胞分离液(1.077 g.mL-1)密度梯度离心法从人的骨髓中分离出MSCs进行体外扩增.收集第2代细胞流式细胞仪检测MSCs表面标志.逐渐加入表皮生长因子(EGF)、巯基乙醇(BME)和全反式维甲酸(ATRA)诱导MSCs向神经元细胞分化,通过免疫细胞化学法鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(nsetin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.结果:流式细胞仪检测结果显示培养后的MSCs强表达CD29;较强表达CD44、CD166和CD105;不表达CD45、CD34和 HLA-DR.诱导剂诱导后,MSCs分化为具有典型的神经元形态的细胞,免疫细胞化学显示78%的细胞NSE表达阳性;大约51%细胞nsetin表达阳性;所有细胞GFAP均阴性表达.结论:成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞,且具有较高的阳性分化率.
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初级纤毛介导的Shh信号对大鼠骨髓基质细胞神经元样细胞分化的影响
目的 探讨初级纤毛介导的Sonic hedgehog(Shh)信号对大鼠骨髓基质细胞(MSCs)神经元样细胞分化的影响.方法 全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs.实验分为白藜芦醇正常培养组、白藜芦醇诱导组、Smoothened (Smo)激动剂SAG组、Smo抑制剂环巴明组,分别给予相应的药物处理.倒置显微镜下观察各组细胞形态;免疫荧光法检测各组细胞初级纤毛及Shh信号通路相关蛋白[Ac-Tu、Patched (Ptc)、Smo、Gli1]的表达;RT-PCR检测各组细胞Smo、Gli1 mRNA的表达;蛋白质印迹法检测各组细胞Smo和Gli1蛋白的表达.结果 正常培养的大鼠MSCs不表达初级纤毛.经过预诱导或饥饿处理24 h后,MSCs表达初级纤毛及Ptc、Smo和Gli1蛋白,其中Smo和Gli1蛋白位于胞质,Ptc蛋白位于初级纤毛.正常培养时,白藜芦醇不能促使Smo移位及MSCs向神经元样细胞分化.当MSCs表达初级纤毛时,白藜芦醇及SAG可使Smo从胞质进入初级纤毛,同时伴随MSCs向神经元样细胞分化及Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达水平的增加(P＜0.05);加入抑制剂环巴明后,Smo仍主要表达于胞质,Smo、Gli1 mRNA和蛋白的表达水平降低(P＜0.05),MSCs向神经元样细胞的分化受抑制.结论 MSCs表达初级纤毛并存在Shh信号,初级纤毛介导的Shh信号参与调控大鼠MSCs的神经元样细胞分化.
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大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经细胞
目的探讨体外β-巯基乙醇(BME)、正规胰岛素(RI)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用.方法取体外扩增至3～4代的大鼠MSCs,分别用BME、RI和bFGF诱导,另设空白对照.诱导后1、5、24 h,计算神经元样细胞的分化率,分别鉴定神经元烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果诱导后1h,BME组分化率高,5 h时bFGF组分化率高,与其他组有显著差异(P＜0.01);BME组和RI组各自1h与5h的分化率有显著差异(P＜0.01);bFGF组5 h和24 h的分化率与1 h的分化率有显著差异(P＜0.01),但5 h和24 h的分化率无显著差异(P＞0.05).结论抗氧化剂和神经营养因子能诱导MSCs分化为神经元样细胞,而且具有较高的诱导效率.胰岛素的作用较弱;BME的诱导作用快而短暂;bFGF的诱导作用缓和而持久.
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体外诱导树鼩骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究
目的 探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向神经元样细胞分化的可行性.方法 通过采用不同诱导物浓度的神经元样细胞诱导液对体外培养的树鼩BM-MSCs向神经元样细胞进行诱导分化,用PCR法检测细胞神经元烯醇化酶(NES)和α-突触核蛋白(α-SYN)表达情况,并用NES抗体进行细胞免疫荧光染色鉴定.结果 使用浓度为10 ng/mL表皮生长因子(EGF)和20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导液在体外诱导培养树鼩BM-MSCs至12d时可以得到良好诱导结果.结论 优化的双细胞因子诱导培养液可以成功将树鼩BM-MSCs诱导分化为神经元样细胞,分化的细胞符合神经元样细胞的一般特征.
关键词： 树鼩 间充质干细胞(MSCs) 体外诱导培养 神经元样细胞 -
大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究
目的 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs),并行多向分化潜能的鉴定.方法 经Percoll 梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞.贴壁培养后, 通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析.传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞的诱导,并行免疫组织化学鉴定.结果 骨髓间充质干细胞大小较为均匀, 基本上呈梭形或星形的上皮样细胞, 传代培养后的细胞体积增大, 成纤维样细胞逐渐增多.经反复传代纯化的MSCs检测CD71、CD29呈阳性表达并证实骨髓间充质干细胞经诱导后分化为脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞.结论 在体外,大鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞.
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血清对骨髓基质干细胞分化的影响
目的探讨血清对骨髓基质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法采用percoll液分离大鼠MSCs,体外扩增,单独应用BHA或BHA加血清定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.结果BHA诱导1.5 h后加入血清,细胞的形态不再分化为神经元,而是逐渐变回原来的MSCs样形态,加入血清后2 d所有细胞均恢复MSCs形态.结论血清可阻碍BHA使MSCs定向分化为神经元.
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维生素C对骨髓基质细胞的诱导分化作用
目的 观察维生素C对骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)向神经元方向分化的作用及对其递质分泌的影响.方法 采用percoll液分离大鼠骨髓基质细胞,体外扩增.当第二或第三代细胞生长达到60%～70%融合时,加入不同浓度的维生素C,分别于不同时间观察其形态学改变,取诱导后的细胞作免疫细胞化学鉴定,取诱导后的诱导液作HPLC测定其中的单胺类递质的含量.结果 用不同浓度的维生索C可使骨髓基质细胞表现出典型的神经元样细胞的形态.免疫组织细胞化学鉴定显示,诱导后的细胞表现为NSE阳性,GFAP阳性.HPLC测定结果显示,用维生素C诱导后,诱导液中的肾上腺素和去甲肾上腺素的含量明显增多.结论 维生素C可诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞方向分化,并且可增加其中单胺类递质的释放.
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多种诱导剂联合对大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经元样细胞分化的影响
目的 探讨多种诱导剂联合对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)体外向神经元样细胞分化的影响.方法 从Wistar大鼠骨髓中分离rMSCs并进行体外培养,经免疫荧光染色及流式细胞仪行CD44、CD45和CD90鉴定后,将传第3代的rMSCs用DMEM、0.1 mmol/L β-巯基乙醇(BME)和2％二甲基亚砜(DMSO)预诱导5h后,给予10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10 μg/L表皮生长因子(EGF)、10 μg/L肌酸联合诱导7d.应用荧光相差显微镜观察细胞形态,免疫荧光染色和流式细胞仪对神经元标志物进行鉴定.结果 诱导后约80％ rMSCs呈神经元样改变,神经元标志物阳性率分别是巢蛋白为(42.14±2.85)％、神经细丝蛋白为(17.13±1.03)％、β-微管蛋白-Ⅲ为(20.42±1.98)％、胶质纤维酸性蛋白为(39.97±2.34)％、微管结合蛋白-2为(39.30±1.72)％、胆碱乙酰转移酶为(21.30±1.83)％.结论 多种诱导剂(BME、DMSO、bFGF、EGF和肌酸)联合可诱导约80％ rMSCs向神经元样细胞分化.
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人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的体外研究
目的 探讨人骨髓间充质干细胞(hMSC)向神经元和多巴胺神经元分化的潜能.方法 分离和纯化hMSCs;在体外以WHI-P131预处理和碱性成纤维细胞生长因子预诱导后,全反式维甲酸和胶质细胞源性神经营养因子联合诱导hMSCs向神经元和多巴胺神经元分化.光镜下观察其分化过程中hMSCs的形态变化,免疫组化检测诱导前后细胞是否表达神经元和多巴胺能神经元标志蛋白.结果 诱导后的hMSCs能分化成为具有典型神经元形态的细胞,并明显表达抗人神经巢蛋白(nestin)[(54.2±3.7)%]和神经元特异性烯醇化酶(NSE)[(77.0±5.7)%],低表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)[(8.8±2.4)%];对照组细胞这些表达均为阴性;而且相当部分hMSCs表达酪氨酸羟化酶(TH)[(36.5±15.8)%]和多巴胺转运体(DAT)[(26.0±14.2)%].结论 在适当条件下,hMSCs可分化成为神经元样细胞和多巴胺神经元样细胞.
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人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究
目的探讨来源于人脐血的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化成神经元样细胞的可行性,以及在体外分离、纯化和扩增的条件.方法无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的MesencultTM作为培养基进行培养和纯化,获得贴壁细胞,取扩增第三代后的MSCs向神经元样细胞诱导分化.用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物.结果来源于脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样和间充质样细胞;传3代后,这些细胞可得到纯化、扩增;免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE).结论源于脐血的MSCs在体外可以培养、扩增,并向神经元样细胞分化,可作为神经干细胞的来源而用于实验研究和临床.
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人骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞移植治疗局灶性脑缺血后神经功能障碍的实验研究
目的 探讨人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)源性神经元样细胞移植对局灶性脑缺血后神经功能缺失的治疗作用.方法 应用胶氧尿苷(Brdu)标记全反式维甲酸联合细胞因子诱导的hBMSCs源性神经元样细胞,通过立体定向分别将磷酸盐缓冲液(BS)、hBMSCs及hBMSCs源性神经元样细胞植入局灶性脑缺血模型大鼠绞状体内.观察移植后各组大鼠神经功能恢复情况.结果 hBMSCs和hBMSCs源性神经元样组术后神经损伤严重缺损评分(NSS)、平衡木试验(BBT)、一次性被动回避平台试验(SDPAT)、水迷宫试验(WMT)较PBS组显著好转(P＜0.01);hBMSCs组术后1、3周NSS、BBT较hBMSCs源性神经元样组明显好转(P＜0.05),术后6、8周两组比较差异无统计学意义(P＞0.05);hBMSCs源性神经元样组SDPAT、WMT较hBMSCs组改善明显(P＜0.05).结论 hBMSCs和hBMSCs源性神经元样细胞脑内移植均能有效改善局灶性脑缺血大鼠的神经功能症状,hBMSCs移植作用快,而hBMSCs源性神经元样细胞移植在学习、记忆功能方面改善更好,可能是治疗局灶性脑缺血的一种方法.
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人脐血MSCs的分离培养及向神经的诱导分化
目的 探讨人脐血中分离所得到间充质干细胞(MSCs)向神经组织细胞诱导分化的实验条件.方法 淋巴细胞分离液分离正常人脐血单个核细胞,利用差速消化法通过多次传代得到MSCs,流式细胞仪测定细胞表型.取2至4代的MSCs加入含有维甲酸(RA)与神经生长因子(NGF)的诱导分化培养基将其定向诱导,免疫细胞化学染色检测诱导后的MSCs神经元和神经胶质细胞标志的表达.结果 脐血MSCs每传一代,细胞数量增加约2～3倍.流式细胞仪检测,脐血MSCs不表达CD34,表达CD25、CD29、CD105、CD106.诱导后的细胞不仅形态类似神经元和神经胶质细胞,而且表达神经丝蛋白200(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP).结论 从人脐血中可以分离得到与骨髓相似的MSCs,并且能够在体外分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞.
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还原型谷胱苷肽诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化形成神经细胞
目的 研究还原型谷胱苷肽(GSH)对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的诱导分化作用.方法 用SD大鼠股骨、胫骨以及肱骨骨髓细胞体外培养.采用GSH诱导rBMSCs 24h,免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)表达率.结果 诱导6、24h时,MSCs分化成神经元样细胞,形成网络状结构,免疫细胞化学染色诱导出的神经元样细胞NSE表达阳性率分别为(64.0±4.3)%和(71.0±5.0)%.结论 GSH可诱导MSCs分化形成神经元样细胞.
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脑脊液对骨髓基质细胞作用的动态观察
目的动态观察脑脊液对骨髓基质细胞向神经元方向分化的作用.方法采用Percoll液分离大鼠骨髓基质细胞,体外扩增.当第2或第3代细胞生长达60%～70%融合时,加入不同病人脑脊液,分别于不同时间观察其形态学改变,取诱导后的细胞作免疫细胞化学鉴定.结果在颅咽管病人脑脊液中骨髓基质细胞的分化速度较快,且发生改变的程度较大;而在脑外伤积水的病人脑脊液中骨髓基质细胞的分化速度相对较慢,且发生改变的细胞数较前者少.免疫细胞化学染色NSE呈弱阳性,NF呈弱阳性.结论脑脊液可诱导骨髓基质细胞向神经元方向分化.
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神经营养因子-3联合全反式维甲酸与β-巯基乙醇诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化效果比较
目的:探讨神经营养因子-3(NT-3)联合全反式维甲酸(RA)与β-巯基乙醇(β-BME)体外诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的差异性.方法:SD大鼠全骨髓经贴壁法培养BMSCs并传代,P3代细胞行流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD90及CD45的表达.P3代BMSCs用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24 h后,再分别加入NT-3+RA和β-BME进行诱导,用免疫荧光法鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况.结果:①全骨髓贴壁法可以获得的细胞经流式细胞仪检测,细胞CD29和CD90阳性,CD45阴性,证实细胞为BMSCs,数量多且纯度高.②2组NSE均阳性表达,NT-3+RA组7 d阳性率高于其他时间点(P<0.01);β-BME组5 h阳性率高于1 h,NT-3+RA组1 h及5 h阳性率均低于β-BME组(均P<0.01),但β-BME组24 h后细胞大量死亡.结论:全骨髓贴壁筛选法是一种提取BMSCs的合适的方法,2种诱导方法均能在体外诱导BMSCs向神经元样细胞转化,NT-3+RA组细胞生存时间及后期阳性率均优于β-BME组.
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依达拉奉体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的电生理研究
目的 探讨新型氧自由基清除剂依达拉奉诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的电生理特性. 方法 Ficoll-Paque 分离液离心分离大鼠骨髓基质干细胞,体外扩增,含依达拉奉的无血清L-DMEM诱导.观察细胞形态变化,Western-blot检测分化前后细胞膜离子通道蛋白表达,全细胞膜片钳检测细胞电生理特性. 结果 分化的骨髓基质千细胞胞体收缩,突起伸出;钠、钾、钙膜蛋白分化前后均有表达,分化后钾、钠、钙膜蛋白表达上调;分化后细胞静息电位值增大,外向电流增大,尤以外向整流钾电流显著. 结论 依达拉奉诱导大鼠骨髓基质干细胞分化的细胞具有神经细胞电生理特性.
