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人脐血非造血干细胞免疫原性的实验研究
目的 探讨人脐血非造血干细胞免疫原性,为脐血非造血干细胞的应用提供依据.方法 通过流式细胞术检测人脐血非造血干细胞的免疫表型;体外混合淋巴细胞培养观察人脐血非造血干细胞原代、P1代、诱导分化细胞及干扰素-γ(IFN-γ)刺激异种T淋巴细胞增殖活化作用.结果 人脐血非造血于细胞表达HLA-ABC,微弱表达HLA-DR,经IFN-γ处理后,未明显改变HLA-ABC、HLA-DR的表达水平.混合淋巴细胞培养未见各处理组人脐血非造血干细胞明显刺激T淋巴细胞的增殖.结论 人脐血非造血干细胞无论原代、传代细胞、分化细胞及IFN-γ处理的细胞免疫原性均较弱.
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羊膜对人脐血干细胞分化为多巴胺能神经元的作用
目的 探讨羊膜上皮细胞对人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的作用.方法 体外分离、原代培养人羊膜上皮细胞,通过高速离心制备成条件培养液(CM)对P1代脐血十细胞进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形念的变化,应用免疫荧光染色和免疫印迹法检测其酪氨酸羟化酶(TH)及多巴胺转运体(DAT)蛋白的表达情况.结果 P1代脐血干细胞经羊膜上皮细胞条件培养液诱导后,TH及DAT阳性细胞率明显高于对照组,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),免疫印迹分析结果 与免疫荧光染色结果 一致.结论 羊膜上皮细胞能诱导人脐血问充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元.
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不同诱导因子对人脐带血非造血干细胞神经分化的影响
目的 探讨诱导人脐带血非造血干细胞向神经细胞分化的佳条件.方法 通过密度梯度离心法原代培养脐带血非造血干细胞;用流式细胞术分析脐带血获得的贴壁细胞的CD34、CD90、CDl66、HLA-ABC、HLA-DR等免疫表型;并用不同诱导因子组合:1.维甲酸(RA);2.表皮生长因子(EGF)+碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);3RA+EGF+bFGF;4二甲基亚砜(DMSO)+丁羟基茴香醚(BHA)诱导后,用免疫荧光化学法检测各组脐带血非造血干细胞中β-微管蛋白-Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖苷酶-C(Gal-C)等神经细胞、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性标记抗原的表达.结果 脐带血非造血干细胞CD90、CD166、HLA-ABC表达阳性;无论那一种诱导因子组合,分化为少突胶质细胞的比率均高于神经元及星型胶质细胞;即各组分化为少突胶质细胞数＞神经元的细胞数＞星型胶质细胞数.对于少突胶质细胞(Ga-C)以RA+EGF+bFGF组合诱导率高,达57.02%,其次是DMSO+BHA诱导组.而对于神经元及星型胶质细胞的分化各组比较,以RA组高,其次是DMSO+BHA诱导组合.结论 RA对神经元及星型胶质细胞的诱导作用较好,而RA+EGF+bFGF组合对于少突胶质细胞诱导作用明显.
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人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的实验研究
目的 探讨人脐血干细胞定向分化为多巴胺(DA)能神经元的佳诱导条件.方法 体外分离、原代培养人脐血干细胞,流式细胞仪检测其表面标志,分别以EGF+bFGF、ATRA、ATRA+EGF+bFGF、纹状体条件培养液、纹状体星形胶质细胞条件培养液对其进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化.应用免疫荧光染色技术检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 比较各组对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用,纹状体星形胶质细胞条件培养液＞纹状体条件培养液＞ATRA+EGF+bFGF组＞ATRA组＞EGF+bFGF组＞对照组.结论 纹状体组织对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用优于其他各组,并且此作用可能主要源于纹状体的星形胶质细胞.
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体外培养人脐带血间充质干细胞向胰岛细胞分化及对糖尿病治疗的实验研究
目的：研究人脐带血间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能及其移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。方法体外分离培养HUCB-MSCs,在胰岛细胞培养条件下经药物定向诱导其分化；免疫组化对诱导细胞进行胰岛β细胞标记鉴定；双硫腙染色鉴定锌离子表达及检测胰岛样细胞的移植效果。结果 HUCB-MSCs经诱导后,免疫细胞化学染色显示表达人胰岛素；双硫腙染色呈棕红色；移植后2周,胰岛样细胞组血糖浓度明显降低。结论 HUCB-MSCs在体外诱导培养条件下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能,这种细胞可能为Ⅰ型糖尿病提供一条新的治疗途径。
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DBBF交联修饰人脐带血血红蛋白的工艺研究
目的 研究治疗脑血管缺氧疾病的创新载氧药物,其主要功能是能够向缺氧组织有效地供氧.恢复无基质血红蛋白的供氧能力是开发载氧药物的关键步骤.双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸脂(bis(3,5-dibromosalicyl)fumarate,DBBF)交联修饰血红蛋白α链的工艺研究,是为开发具有合适亲氧性的载氧药物奠定基础.方法 电泳和HPLC检测聚合程度,在生理条件下检测其生物活性和P50(血红蛋白到达氧半饱和态所对应的氧分压).结果 DBBF有效地交联血红蛋白(hemoglobin,Hb),既恢复了无基质血红蛋白(stroma-free hemoglobin,SFHb)的P50,又增加了血红蛋白四聚体的稳定性,很好地保持了血红蛋白的生物活性.结论 DBBF-αHb作为开发具有合适亲氧性的载氧药物的第一步,为后续工作奠定了基础.
关键词： 双(3 5-二溴水杨基)延胡索酸脂 血红蛋白 人脐带血 P50 -
血红蛋白为基础的红细胞代用品以[p(O2)]50测定方法的研究
目的 对血红蛋白(Hb)为基础的红细胞代用品以人脐带血Hb及其聚合Hb氧合曲线的测定方法进行研究.方法 Hb与氧结合的能力通常用氧分压[p(O2)]和Hb氧饱和度(Y)构成的氧合曲线来表示.制备人脐带血纯化Hb、聚合Hb,测定高铁Hb浓度,用高效液相色谱(HPLC)测定各种Hb浓度,做氧合曲线.结果 改进检测方法和装置后,得到S形的氧合曲线,测得人脐带血纯化Hb样品的[p(O2)]50为(0.934 ± 0.009) kPa[(7.17 ± 0.07) mmHg],5′-磷酸吡哆醛(PLP)修饰的聚合Hb [p(O2)]50为(2.727 ± 0.033) kPa[(20.50 ± 0.25) mmHg].结论 该方法设备简单、操作方便、结果可靠、重复性和重现性较好.
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人脐血干细胞的特性及其神经分化的研究进展
寻找一种合适的细胞来源进行移植以代替受损的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞来修复神经损伤已成为人们的研究热点.早在20年以前,Ogawa等人就发现在人脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)中存在原始的造血干细胞,随着近年来研究的深入,发现脐带血中不但含有丰富的造血干细胞,而且还含有大量的多潜能干细胞,可以向内皮、血管以及神经等组织分化,由于其具有来源丰富、采集方便且无伦理学等问题,人脐血干细胞(HUCBC)的研究逐渐引起研究者的广泛兴趣.
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脐带血造血干/祖细胞罗丹明123荧光染色及其意义
目的 探讨人脐带血造血干,祖细胞(UCB-HSPC)罗丹明123(Rh0123)荧光染色特点及其应用价值.方法 采用密度梯度离心法获取脐带血单个核细胞(UCB-MNC),用含终浓度为0.1 μg/ml Rh0123的2%胎牛血清-PBS液、37℃下孵育UCB-MNC细胞(细胞浓度为106/ml)20 min,之后用Lin抗体(PE标记的CD19、CD13、CD2、CD8、CD3)及造血干,祖细胞(HSPC)标志抗体CD34-PerCP和CD38-APC标记UCB-MNC细胞,流式细胞仪分析HSPC亚群及其Rh0123染色特点.结果 流式细胞术检测结果表明,UCB-Lin-MNC中的HSPC比例高于MNC中约6倍;UCB-CD34+CD38+造血祖细胞(HPC)的Rh0123染色平均荧光强度值为23.55±2.40,是UCB-CD34+CD38-造血干细胞(HSC)值10.2±21.03的2倍多(P<0.01).结论 UCB-Lin-MNC中富含HSPC;UCB-HSC的Rho123染料聚集能力明显低于UCB-HPC,提示Rh0123拒染法可作为进一步纯化人UCB-HSC的新手段.
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人脐带血多能干细胞的体外分离培养及其生物学特性
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一群来源于中胚层的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,广泛分布于各种不同的组织中,如骨髓、外周血、脐血、脂肪、胎肺和胎肾等组织[1-2].MSCs的自我更新、多向分化的潜能以及它们所具有的低免疫原性和免疫抑制的作用,为临床应用的安全性和有效性提供了可靠的理论依据,同时大大扩展了其临床适应症的选择范围,即不仅可用来进行各种推行性和衰竭性疑难病症的替代治疗,也可以用来进行辅助的免疫治疗[3].
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人脐带血间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究
目的:探讨并建立稳定可靠的人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)体外分离和培养方法.方法:采用密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞,利用MSC易黏附塑料贴壁生长的特性,分离MSC并进行体外扩增培养,观测其形态学特征,绘制不同代数hUCBMSC生长曲线,流式细胞技术检测细胞表面标志物CD29、CD34、CD105、HLA-DR等表达情况.结果:本法可成功、可靠地在体外自hUCB中分离培养出粘附细胞,该细胞在体外培养呈梭形或成纤维样,其指数生长倍增时问约为36h,其细胞表面表达β1整联蛋白CD29、CD105(endoglm),不表达造血细胞标志物CD34以及HLA-DR.结论:人脐带血中存在问充质干细胞,采用优化的实验方法可以提高培养成功率,稳定获得MSC并体外扩增培养.人脐带血可以作为获得间充质干细胞稳定充足的来源.
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显微注射技术的改进和用灵长类间充质干细胞制备嵌合体小鼠
显微注射法制备嵌合体动物,早在Gardner[1,2]1968年报道,他们将小鼠胚胎泡内细胞群细胞注射入另一种毛色基因不同的小鼠胚泡中,获得毛色混杂的嵌合鼠.随后,显微注射法逐步发展起来,上世纪90年代起,主要通过转入外源基因的小鼠ES细胞(embryonic stem cell)显微注射,制备嵌合体,进而获得转基因小鼠.但对成体干细胞在异种动物内的嵌合报道不多.Harder[3,4]等将人脐带血来源的造血干细胞注射到小鼠胚泡中,发现在成年小鼠造血系统中有人的细胞嵌合.我们改进了显微注射技术,并通过该技术探讨了灵长类动物骨髓来源间充质干细胞的嵌合体构建,建立了干细胞在体内分化技术平台.
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人脐带血间充质干细胞的富集与表型鉴定
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)具有自我更新和分化为具有骨、软骨、神经元和脂肪细胞表型细胞的能力.目前,骨髓源MSC仍是MSC的主要来源,但因其取材属侵袭性,且伴随年龄的增长骨髓MSC其数目和增殖分化能力均大大降低,使得利用骨髓源MSC的可能性受到制约[1].近年来的研究表明,除已知的人骨髓、软骨、脂肪组织中存在MSC外,脐带血(umbilical cord blood,UCB)中也存在MSC[2].由于UCB的采集不会对新生儿造成任何伤害,所含细胞成熟度低,也无伦理上的争议,因而被认为是替代骨髓细胞的理想选择.目前,已有从人UCB分离造血干细胞的成熟方法,但尚无富集UCB-MSC的适宜方案可循.本研究旨在探寻从UCB中分离MSC的适宜方法,并对分离的UCB-MSC细胞进行表型分析、鉴定,为下一步UCB-MSC的分化潜能和临床应用研究奠定基础.
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体外扩增人脐带血来源的NK细胞对食管癌细胞的促凋亡作用
目的:建立体外扩增人脐带血来源的NK细胞的方法,并研究其对多株人食管癌细胞系和食管癌患者原代肿瘤细胞的杀伤作用.方法:分离人脐带血单个核细胞,加入放射线灭活的人白血病K562细胞及IL-2、IL-15、IL-18细胞因子体外扩增培养2周,诱导NK细胞.采用流式细胞术检测NK细胞的扩增效果及其产生的IFN-γ,等细胞因子杀伤靶细胞K562的能力,并检测体外扩增的人脐带血来源NK细胞对多种食管癌细胞系和食管癌患者原代肿瘤细胞凋亡的影响.结果:利用放射线灭活的K562细胞联合多种细胞因子,可以有效的扩增人脐带血来源的NK细胞.体外培养2周后NK细胞比率可达80％左右,并对靶细胞K562有明显促凋亡作用.此外,体外扩增的人脐带血来源NK细胞能够促进6株人食管癌细胞系和食管癌患者原代肿瘤细胞的凋亡.结论:本研究建立了体外扩增人脐带血NK细胞的方法,并证实这些NK细胞对食管癌细胞的促凋亡作用,可能为食管癌的免疫治疗提供新的手段.
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人类脐带血间充质干细胞的培养及鉴定
目的 对人类脐带血中的有核细胞进行分离培养及鉴定,观察能否得到间充质干细胞.方法 抽取人类脐带静脉血,进行细胞分离和培养,并进行荧光激活细胞分析.结果 脐带血中间充质干细胞与骨髓中的类似,其外表呈纤维样;流式细胞术鉴定结果表明这种细胞能表达CD29、CD44、CD90、CD95、CD105、CD166以及MHCⅠ(组织相容性抗原复合体Ⅰ),但不能表达CD14、CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、CD117、CD152以及MHC Ⅱ(组织相容性抗原复合体Ⅱ);并且具有分化成骨细胞和脂肪细胞的潜能.结论 可以从人类脐带血中成功分离培养得到间充质干细胞.
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体外培养人单个核细胞分泌IFN-γ水平的观察
目的对体外培养的人脐带血和外周血单个核细胞(MNC)以植物血凝素(PHA)刺激,观察培养上清中IFN-γ含量变化.方法常规Ficoll离心法分离人MNC,接种24孔培养板,同时加入PHA,体外培养5 d,计数不同培养时间的细胞总数;ELISA法测定不同培养时间上清中的IFN-γ含量.结果经PHA刺激后,脐血MNC数量约扩增了12倍,单位细胞量所分泌的IFN-γ是健康人血浆水平的30倍.而健康人外周血MNC数量约扩增了5倍.单位细胞量所分泌的IFN-γ是健康人血浆水平的15倍.结论与人外周血MNC相比,人脐带血MNC对PHA刺激具有良好的反应性,经PHA刺激后可分泌更高水平的IFN-γ,表明其在移植物抗白血病(GVL)效应中起一定作用.
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人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究
目的探讨来源于人脐血的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化成神经元样细胞的可行性,以及在体外分离、纯化和扩增的条件.方法无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的MesencultTM作为培养基进行培养和纯化,获得贴壁细胞,取扩增第三代后的MSCs向神经元样细胞诱导分化.用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物.结果来源于脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样和间充质样细胞;传3代后,这些细胞可得到纯化、扩增;免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE).结论源于脐血的MSCs在体外可以培养、扩增,并向神经元样细胞分化,可作为神经干细胞的来源而用于实验研究和临床.
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脐带血移植的研究进展
1984年Boyce等［1，2］发现人脐带血中含有造血干细胞，并认为脐血可能是临床上造血干细胞的一种来源。继之，Broxmeyer等用实验研究方法证实脐血及胎盘血中含有丰富的造血干/祖细胞。1988年法国巴黎圣路易医院Gluckman等［3］首先进行了HLA完全相同的脐血移植，治疗1例Fancomi贫血患儿，并获得成功。此后，世界各地逐步开展脐血移植工作。到1998年为止，全世界已进行300多例同胞间脐血移植及700多例非血缘间脐血移植。日本，到1998年7月止，已完成了22例同胞间的脐血移植及27例非同胞间的脐血移植［4］。国内，自1983年以来，陆续开展脐带血输注治疗血液病。近年来，同胞间脐带血造血干细胞移植已在河南、广州等地少数病例移植成功。非血缘关系脐血移植也正在开展。北京、广州等地已作了脐血HLA配型，并已冻存了2000份以上［5］。
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人脐血间质干细胞向神经元样细胞诱导分化促进大鼠脊髓损伤神经恢复
目的 观察移植人脐血间充质干细胞诱导分化的神经元样细胞是否可以促进大鼠脊髓损伤的功能恢复.方法 30只SD大鼠随机分成移植组和对照组.建立NYU脊髓损伤模型.移植组移植Hoechst标记的源于脐血间充质干细胞在体外培养、扩增,向神经元样细胞分化的细胞,并用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物.对照组注射PBS液.采用BBB评分标准对两组所有大鼠术前和术后24 h,1、2、3、4、5周进行运动功能评价,组织学和免疫组化分析移植细胞的定位和分化情况.结果 经诱导后的脐血间充质干细胞表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶,移植后在脊髓病理切片中出现Hoechst标记的移植细胞,5周后移植组功能恢复比对照组明显(P＜0.05).结论 移植人脐血间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞可以促进鼠脊髓损伤的功能恢复.
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人脐带血内皮祖细胞的分离、培养与鉴定
目的：：分离、培养、鉴定人脐带血内皮祖细胞( EPCs),为获取大量血管内皮祖细胞提供方法。方法：脐带血采集后,采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法获取脐带血单核细胞,再将单核细胞接种于铺设有纤维连接蛋白的培养瓶中,经过体外诱导、培养、分化,完成传代扩增；通过免疫组织化学、免疫荧光染色、流式细胞术对细胞进行鉴定。结果：细胞培养第5天呈现集落样生长,单个细胞呈圆形或梭形,2周后细胞长满瓶底,呈鹅卵石样外观。免疫组织化学检测显示,CD31兔抗人单克隆抗体阳性率91.5%,Anti-Von Willebrand factor antibody(vWF)相关抗原兔抗人单克隆抗体的阳性表达率为72.4%；细胞免疫荧光染色检测显示,吞噬Dil标记的乙酰低密度脂蛋白(+),发出红色荧光；结合FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ(+),发出绿色荧光；双染(+),呈黄色荧光。流式细胞术检测CD34阳性率93%,血管内皮细胞生长因子受体2阳性率88.5%,CD133阳性率84.8%。结论：从脐带血中可获取大量CD34+、VEGFR-2+及CD133+血管内皮祖细胞。
