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盐酸克伦特罗对鸡胚胎发育的影响
目的 研究盐酸克伦特罗对鸡胚胎发育的影响.方法 分别注射盐酸克伦特罗浓度为0.5、1、1.5、2和2.5 mg/ml的生理盐水0.2 ml到30枚发育至第9天的鸡胚,对照组仅注射0.2 ml不含盐酸克伦特罗的生理盐水,检测盐酸克伦特罗对鸡胚孵化率、体重、临床表现及内脏器官的影响.结果 盐酸克伦特罗对0.5 mg/ml组的鸡胚孵化率有显著影响,对1、1.5、2和2.5 mg/ml组鸡胚的孵化率有极显著影响.但对雏鸡体重影响不大[F=1.32＜F0.05(5,61)=2.36].实验组的鸡胚同时表现出了较明显的中毒症状.肝脏和心脏所受的毒害影响尤为严重.结论 盐酸克伦特罗对鸡胚胎发育有较明显的毒害,对心脏和肝脏的损害尤其明显.
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天津市2002年冬至2003年春流行性感冒病原学检测分析
为了解天津市流行性感冒(流感)流行情况,自2002年10月至2003年3月对天津市四家医院和两所学校采集流感样患者咽拭子标本,用MDCK细胞和鸡胚两种接种方法分离流感病毒.结果共采集流感样患者咽拭子标本305份,分离到流感病毒123株,其中B型90株占73.2%,A(H3N2)亚型33株占26.8%,A(H1N1)亚型未被分离到.总分离率为40.3%,如将2002年12月医院门诊(55/99)与学校采样(9/13)的两组数据汇总,该月的病毒分离率达57.1%(64/112),形成峰顶.所分离的90株B型流感病毒,其中4株为Yamagata系,占4.4%(4/90);其余的95.6%均为Victoria系.123株流感病毒均首先分自MDCK细胞,将对应的标本液直接接种鸡胚,仅收获到3株阳性尿囊液,阳性率2.4%(3/123),且均为B型毒株;阳性细胞液转种,有96.7%的B型毒株能适应生长,而33株A(H3N2)亚型毒株虽经反复转种却无一株转变为鸡胚生长适应株(0%).红细胞凝集试验中96.7%(87/90)的B型毒株的第一代细胞培养液具有D相特征(即与人O型红细胞及鸡红细胞均凝集良好),其余3株(3.3%)B型毒株及全部33株A(H3N2)亚型毒株均具只凝集人O型红细胞的O相特征,将A(H3N2)毒株在MDCK细胞上反复传代,但仍持续保持O相特征.
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白花前胡甲素和丙素对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成影响的实验研究
目的 探讨白花前胡甲素(Pd-Ia)及白花前胡丙素(Pra-c)对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型血管生成作用的影响.方法 将鸡胚随机分为生理盐水组、溶媒对照组、贝复济(bFGF)组、Pd-Ia 0.2mmol·L-1组、Pra-c 0.1mmol·L-1组、Pra-c 1mmmol·L-1组,检测各组CAM的血管增生程度.结果 在血管新生方面,实验所用浓度的Pd-Ia和Pra-c均具有较明显的作用,与生理盐水组和溶媒对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05),而与阳性对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 Pd-Ia和Pra-c可促进CAM血管增生,具有一定的促血管新生作用.
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中药促进神经再生的实验研究
目的:观察中药对神经再生的作用.方法:以鸡胚背根神经节和大鼠腓总神经为实验对象,随机分为空白组和不同药物浓度实验组.采用体外培养法观察中药对神经节生长的影响.以手术暴露、钳夹法造成大鼠腓总神经损伤模型,灌胃给药,应用病理形态学技术和神经生理技术,观察腓总神经再生情况.结果:一定浓度的人参、黄芪、淫羊藿、党参、地龙、鹿茸、川芎组神经纤维长度较空白组长(P＜0.05,P＜0.01),当归、赤芍、骨碎补、桃仁、川续断组神经纤维长度与空白组比较无明显差异(P＞0.05);红花、牛膝组神经长度较空白组短(P＜0.05).马钱子组在浓度为0.025%以下时,与空白组比较,神经纤维增长(P＜0.05);浓度为0.05%以上时,与空白组比较,神经纤维缩短(P＜0.05).淫羊藿组神经增长与药物存在量效关系(P＜0.05).加味补阳还五汤组与对照组比较,髓鞘细胞排列密集、数量增多,轴索再生率高,并能促进神经传递的恢复(P＜0.05).结论:中药对神经再生具有影响,适宜的中药在适宜浓度下对神经再生具有促进作用.
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小柴胡汤及其加减方体外抗流感病毒的实验研究
小柴胡汤来源于<伤寒论>,是和解少阳的代表方,临床上常用于感冒、流行性感冒、慢性肝炎、胸膜炎、中耳炎、淋巴腺炎、产褥热、睾丸炎、急性乳腺炎、急慢性胆囊炎、胃溃疡等属少阳病证的治疗.小柴胡汤加减方是笔者经多年临床探索研究,用于治疗流行性感冒等病毒性疾病的经验方.笔者通过实验研究,检测了小柴胡汤和小柴胡加减方体外抗流感病毒的作用,现将结果报告如下.
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5种淫羊藿对软骨组织生长和软骨细胞增殖影响的对比研究
目的:对比研究心叶淫羊藿、箭叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿、巫山淫羊藿和川西淫羊藿对软骨生长和软骨细胞增殖活性的影响.方法:以鸡胚股骨组织为研究对象,采用配对试验设计,把同一鸡胚的两个股骨组织分别分入对照组或实验组,每组共10个股骨组织.对照组股骨组织在不含中药的培养液中培养,实验组股骨组织在含3%淫羊藿提取物的培养液中培养.以软骨长度、软骨重量、软骨细胞增殖(MTT法)为指标观察5个品种淫羊藿的软骨生物活性.结果:心叶淫羊藿和箭叶淫羊藿实验组的股骨长度、股骨湿重、股骨干重及细胞增殖量指标均高于对照组(P＜0.01),而朝鲜淫羊藿、巫山淫羊藿和川西淫羊藿实验组的股骨长度、股骨湿重、股骨干重及细胞增殖指标与对照组结果相近,差异无显著性.结论:心叶淫羊藿和箭叶淫羊藿具有明确的促进体外软骨生长和软骨细胞增殖的作用,而朝鲜淫羊藿、巫山淫羊藿和川西淫羊藿品种没有表现出这种生物活性.
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Ubc9对鸡胚神经嵴细胞发育的影响
目的 探索Ubc9和SUMO通路对鸡胚神经嵴细胞发育的影响.方法 1)采集鸡胚,通过免疫荧光实验和原位杂交实验来检测SUMO结合酶Ubc9及神经嵴细胞标志基因的表达情况.2)设置对照组(非特异性吗啉代处理)和Ubc9-吗啉代组来处理各组8期鸡胚,随后通过原位杂交实验检测Snail2,Sox9和FoxD3等神经嵴细胞晚期标志基因的表达情况.结果 1)Ubc9与标志基因Pax7共表达于4、6和8期鸡胚神经嵴细胞前体.2)与对照组相比,Ubc9-吗啉代组鸡胚单侧上Snail2(P＜0.05),Sox9(P ＜0.01)和FoxD3(P＜0.05)的mRNA水平均有下降.结论 Ubc9表达于4、6和8期鸡胚的神经脊细胞前体,鸡胚神经嵴细胞的形成需要SUMO通路参与.
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鸡胚原始生殖细胞定向诱导分化为脂肪和神经元样细胞
目的 探索培养传代后鸡胚原始生殖细胞(EPGCs)的多向分化潜能,比较不同诱导程序、不同特异性化学诱导剂及其协同作用.方法 分别获取发育至19期和28期的鸡胚PGCs,体外培养传代到第4代.采用不同诱导程序、不同组合的诱导剂地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1.甲基黄嘌呤(IBMx)诱导EPGCs向脂肪细胞分化.采用不同诱导程序、不同组合的诱导剂维甲酸(RA)、丁化羟基苯甲醚(BHA)、IBMx、二甲基亚砜(DMSO)诱导EPGCs向神经元样细胞分化.结果 1.EPGCs被诱导7～21d后,分化成脂肪细胞,其中诱导程序(2)(见正文中叙述)的诱导分化效果较好,第19、28期分化率分别为89%和91%.诱导剂联合协同作用的诱导效果极显著地(P＜0.01)高于单独作用的诱导效果.诱导的脂肪细胞经特异性的油红O和苏丹红染色为阳性,并检测到特异性过氧化物酶体增生物激活受体?(PPAR-?)的表达.2.EPGCs被诱导3～7d后,分化成神经元样细胞.RA、IBMx单独使用对神经元样细胞的形成率分别为82%和83%,极显著地(P＜0.01)高于RA、BHA、DMSO和IBMX的协同作用的效果.诱导的神经元样细胞特异性免疫组织化学检测显示,均有神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白M(NFM)的表达,而无胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结论 鸡EPGCs体外培养传代后仍具有多向分化潜能,在特异化学物质的诱导下,可被定向诱导分化为脂肪细胞、神经元样细胞.
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鸡胚胎原始生殖细胞对不同冷冻体系适合性的研究
目的研究鸡胚胎原始生殖细胞(EPGCs)对不同冷冻体系的适合性. 方法对发育至第19期和第28期胚胎性腺PGCs,采用二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、聚乙二醇为冷冻保护液,在不同组合、不同浓度、不同的冷冻程序下进行超低温冷冻保存.结果1.采用同一种冷冻保护液,10%浓度与15%浓度之间,除DMSO+乙二醇(冷冻保护液Ⅳ)外,其他类型的冷冻液对EPGCs保存后存活率的影响差异不显著(P＞0.05);20%浓度的各种冷冻保护液对EPGCs保存后的存活率低,且与10%和15%浓度相比差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);2.采用同一种冷冻保护液,浓度为10%时,冷冻程序Ⅰ(2～4℃平衡45～60min,-4～-6℃诱发结晶45min,悬挂液氮面1 h以上,投入液氮保存)和冷冻程序Ⅱ(2～4℃平衡90～120 min,悬挂液氮面1 h以上,投入液氮保存)对EPGCs冷冻后存活率差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);3.采用冷冻程序Ⅰ,浓度为10%时,不同的冷冻保护液对EPGCs保存后的存活率影响显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),DMSO+乙二醇(冷冻保护液Ⅳ)显示出好的保护效果;4.第19期和第28期性腺中的EPGCs在相同的冷冻条件下冷冻后,存活率差异不显著(P＞0.05). 结论采用冷冻程序Ⅰ,在10%的DMSO+乙二醇(冷冻保护液Ⅳ)的保护下对鸡EPGCs冷冻较为适合.
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不同浓度曲古抑菌素A对鸡胚翅芽发育的影响
目的 观察组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对鸡胚翅芽发育中某些基因表达水平的作用,探讨不同浓度TSA(75μmol/L、750 μmol/L、1.5mmol/L)对鸡胚翅芽发育的影响,提高我们对染色质结构重组和表观遗传对基因表达的调控作用,以及对正在开发的抗癌药物的认识. 方法以鸡胚翅芽作为实验模型,用TSA处理翅芽,对鸡胚胎实施原位杂交,检测与肌肉发育相关基因的表达,并采用硫酸耐尔蓝(Nile bluesulfate)法检测细胞凋亡状况. 结果 75 μmol/L TSA能够抑制与肌肉发生相关的基因MyoD和Myf5在鸡胚翅芽的表达,经TSA(75μmol/L)处理的胚胎没有发生明显的细胞凋亡.但是随着TSA药物浓度的提高,TSA(≥750μmol/L)不仅强烈抑制相关基因的表达,而且出现翅芽外部畸形(外形改变、体积缩小)以及细胞凋亡. 结论75μmol/LTSA调控某些重要的转录因子及有力地控制肌肉细胞的分化;高浓度TSA(≥750μmol/L)导致细胞凋亡和胚胎翅芽畸形;发育的鸡胚能够作为一个便利的,供体内研究药物(如HDAC抑制剂类等)的模型.
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鸡胚房间隔与第二孔的形态发生
目的探讨心脏房间隔与第二孔形态发生机制. 方法按Hamburger和Hamilton分期法,选用第20～26期鸡胚,用显微解剖术和扫描电镜方法,观察房间隔与第二孔的形态发生过程. 结果房间隔尚未与心内膜垫融合前,房间隔中央部上皮处出现小孔,小孔随着长突起状细胞的出现而增多.筛状的第二孔形成后,长突起状细胞减少并消失. 结论第二孔形成不是被动破裂的过程,在形成的早期可能与长突起状细胞有密切关系.
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EphB/Ephrin-B1信号对睫状神经节α7-尼古丁乙酰胆碱受体电流的影响
目的 探讨EphB/Ephrin.B1信号对鸡胚睫状神经节(CG)神经元上α7-尼古丁乙酰胆碱受体(α7-nAChRs)电流的影响. 方法用膜片钳技术分别在培养的和急性分离的CG神经元上记录α7-nAChRs电流.细胞被随机分为:对照组、Ephrin-BlFc处理组、IgG处理组和Ephrin-B1处理组,观察电流的变化. 结果对照组、lgG组和Ephrin-B1处理组之间α7-nAChRs电流无显著差异(P>0.05),而这3组与Ephrin-BlFc处理组之间有显著差异(P<0.05).Ephrin-BlFc可浓度依赖性抑制α7-nAChRs电流,该过程可在数分钟内发生,并呈现可逆性.培养的和急性分离的CG神经元Ipeak/Cm的IC50分别为0.032mg/L和1.4mg/L. 结论 Eph/Ephrin-Bl信号町影响CG神经元α7-nAChRs的电流,提示Eph/Ephrin-Bl可能参与交感神经系统功能的调控.
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成纤维细胞生长因子信号调控早期鸡胚胎神经嵴细胞的迁移
目的 利用Sprouty2基因阻断成纤维细胞生长因子(FGF)信号,探讨FGF在早期鸡胚胎发育过程中对神经嵴细胞迁移的影响及其机制. 方法 通过体内培养的方法孵育鸡胚至HH9期,通过显微注射的方法将Sprouty2-绿色荧光蛋白(GFP)质粒注射入神经管腔内.实验侧使用电穿孔转染的方法转染胚胎半侧神经管,另一侧正常神经管设为对照侧.采用神经嵴细胞特异标记物HNK1免疫荧光的方法检测Sprouty2基因阻断FGF信号后是否影响胚胎头部和躯干部神经嵴细胞的迁移过程.随后,进一步通过检测神经细胞钙黏分子N-Cadherin的表达来观察细胞之间黏附作用的改变. 结果 HNK1免疫荧光检测结果显示,Sprouty2转染侧即阻断FGF信号通路后,HNK1在早期鸡胚胎的头部和躯干部的表达量均比对照侧的表达量增多；而神经细胞钙黏分子N-Cadherin检测结果表明,Sprouty2转染侧和正常对照侧N-Cadherin在头部和躯干部神经管上表达量的差异均无显著性. 结论 Sprouty2基因阻断FGF信号后,促进了早期鸡胚胎神经嵴细胞的迁移,但是FGF信号对此过程的影响可能不是由神经钙黏分子N-Cadherin介导的.
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鸡胚发育过程中Shh超表达对脊髓神经纤维投射的抑制作用
目的 探讨鸡胚发育过程中,sonic hedgehog(Shh)在脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响.方法 在鸡胚龄2.5々3d(E2.5～E3)时,利用鸡胚活体原位电转基因技术将Shh表达质粒和携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒共转入鸡胚脊髓,E6时取材切片,至少取3个材料,免疫荧光技术检验Shh的超表达,利用Open Book技术研究Shh在鸡胚脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响.结果 在脊髓组织切片水平上,免疫荧光结果表明,Shh在鸡胚脊髓中成功超表达,无论在组织切片上还是通过Open Book技术进行观察,与对照组相比,超表达后转染侧神经纤维都无法正常通过底板投射到对侧,表明Shh在鸡胚脊髓神经纤维投射方面具有重要作用.结论 在鸡胚发育过程中,脊髓中Shh超表达后对神经纤维投射具有抑制作用.
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鸡源Wnt3a融合蛋白表达载体的构建及其对鸡胚脊髓神经前体细胞增殖和轴突形成的影响
目的 构建鸡源Wnt3a融合蛋白真核表达载体(pCAG-MCs-Wnt3 a-EGFP),并探讨其在鸡胚脊髓发育过程中超表达后对神经前体细胞增殖及轴突形成的影响.方法 利用分子生物学手段,提取鸡胚脊髓总RNA并获得Wnt3a片段,将其克隆到pCAG-MCs-EGFP载体中构建pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体.在鸡胚发育至2.5～3d (E2.5～E3)时,利用鸡胚活体电转技术将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP(实验组)和pCAG-MCs-EGFP(对照组)质粒分别转入鸡胚脊髓,E4时取材切片,每组5个胚胎组织,采用免疫荧光染色技术检测Wnt3a和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达变化分析Wnt3a与细胞增殖间的关系,根据载体自发绿色荧光蛋白(GFP)观察脊髓神经前体细胞轴突生成情况.结果 pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体基因测序结果与Gene bank中基因序列一致,将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP入鸡胚脊髓中发现绿色荧光.在脊髓组织切片水平上,免疫荧光染色结果表明,Wnt3a在鸡胚脊髓中能够超表达.Wnt3a超表达后,与对照组比较,含有轴突的神经元数量明显减少(n=3,P＜0.01),而PCNA的表达量显著增加(n=3,P＜0.01).结论 成功构建了鸡源性Wnt3a融合蛋白真核表达载体,并证实Wnt3a在鸡胚发育过程中促进神经前体细胞的增殖并抑制轴突的形成.
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不同发育时期鸡胚脊髓内背侧抑制性轴突导向蛋白的表达和神经嵴细胞迁移之间的相关性
目的 探讨不同发育时期的鸡胚脊髓内背侧抑制性轴突导向蛋白(draxin)表达与神经嵴迁移之间在空间分布上的相关性.方法 选取HH 15-16、HH19-20阶段鸡胚各10只,应用原位杂交、免疫组织化学等方法,观察各阶段鸡胚脊髓内draxin的表达部位及神经嵴细胞迁移路径,同时比较两者在空间分布上的相关性；应用活组织切片与碱性磷酸酶标记的draxin融合蛋白(draxin-AP)体外孵育的方法,检测迁移路径内的神经嵴细胞是否具有与draxin蛋白直接结合的能力.结果 随着发育时间的推移,鸡胚脊髓内draxin的表达和神经嵴迁移都具有明显的由颅侧向尾侧渐进性分布的特性,且draxin的表达部位位于神经管背侧、顶板和背侧生皮肌节之间,这些部位恰均位于神经嵴迁移路径的周围；同时迁移路径内的神经嵴细胞具有与draxin蛋白体外直接结合的能力.结论 draxin表达在神经嵴迁移路径周围且部分神经嵴具有与draxin蛋白体外直接结合的能力,推测draxin可能在鸡胚脊髓神经嵴迁移过程中发挥重要的调节作用.
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鸡胚发育过程敲减神经型钙黏蛋白表达对视顶盖神经元迁移及神经丝蛋白的影响
目的 阐明鸡胚发育过程神经型钙黏蛋白(N-cadherin)在中枢神经系统中的作用及其对神经丝蛋白(NF)表达的影响.方法 鸡胚正常培养到第3天(E3),采用鸡胚带壳开窗培养方法,取出3～4ml蛋清,开窗培养至E5,将N-cadherin干扰载体pGPU6-GFP-neo-N-cadherin-shRNA通过活体电转基因技术导入视顶盖,电转后继续培养到E12,每组收集3个胚胎,取材,固定,包埋,切片后进行荧光免疫组织化学分析相关蛋白的表达.结果 鸡胚发育过程,敲减N-cadherin表达影响神经元迁移,被敲减的细胞主要停留在室管膜区,在N-cadherin受到抑制表达的区域,NF的表达也受到抑制,其表达明显减弱.结论 N-cadherin的抑制表达可导致神经元的迁移发生紊乱,影响NF的表达.
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基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能方法的建立
目的 建立一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞(NSCs)相关基因功能的方法.方法 RT-PCR检测鸡胚发育不同时期脊髓NSCs表面标志物;在鸡胚胚龄(E) E2.5 ～E3时,利用活体电转基因技术将pCAGGS-GFP质粒转染到鸡胚脊髓,E6时体视荧光显微镜下筛选绿色荧光蛋白(GFP)阳性胚胎,每组至少取材5个;通过脊髓横切及open-book技术观察神经纤维投射情况;普通光学显微镜下剥离出3～5条脊髓,经胰蛋白酶消化、离心后,无血清NSCs培养基重悬获得细胞铺板,于37℃、5％ CO2细胞培养箱内培养,定时观察GFP阳性脊髓NSCs的形态变化.结果 RT-PCR结果表明,鸡胚脊髓中阳性表达NSCs表面标志物;随后的脊髓横切及open-book结果表明,GFP阳性转染侧的神经纤维能穿过底板,投射到脊髓对侧;而脊髓NSCs体外培养结果显示,GFP标记的脊髓细胞具有典型的NSCs形态,继续培养后有明显突起产生.结论 本实验成功建立了一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能的方法.
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一种鸡胚发育过程脊髓神经纤维投射研究方法的建立
目的：建立一种鸡胚发育过程脊髓神经纤维投射的研究方法。方法采用鸡胚带壳开窗培养技术，在鸡胚胚龄3d（E3），通过活体电转基因技术将携带有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的质粒（pCAGGS-GFP）准确注射到脊髓腔进行定时定位活体电转，转染后3d在体视荧光显微镜下进行观察；取出GFP阳性表达的胚胎，剥离出脊髓，从顶板处破开之后将脊髓展开，用4％多聚甲醛固定1h后，对神经钙黏蛋白（N-cadherin）进行免疫荧光染色，用4’6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染细胞核；封片后在荧光显微镜下观察神经纤维投射情况。结果对比横向切片和脊髓展开标本，两者均观察到GFP阳性转染侧的神经元纤维穿过底板沿对侧脊髓白质区边缘投射到神经结节，在脊髓展开标本中还可观察到神经纤维穿过底板再纵向向脑部投射；而N-cadherin免疫荧光染色结果表明， GFP基因的转染对机体正常的发育无明显影响。结论本实验建立了一种鸡胚发育过程脊髓神经纤维投射的研究方法。
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一种自制电极鸡胚视顶盖转基因技术
目的 建立一种高效鸡胚视顶盖电转基因技术,对自制电极进行评估.方法 在鸡胚发育的第5天(E5),将0.5 g/L的pCAGGS-绿色荧光蛋白(GFP)质粒0.25 ～ 0.5μl准确地注射到视顶盖内,每组60个鸡胚,在电压18V、每次脉冲60ms、间隔100ms、电脉冲6次的条件下,以原装电极为对照,自制电极为实验组进行定时定位活体电转基因,电转后在E6～E12时观察胚胎成活率,取材后在体视荧光显微镜下观察报告基因GFP表达结果以此判断转染的效率.结果 在鸡胚模型中,通过自制电极转染鸡胚视顶盖,24h后鸡胚成活率达到89％,在鸡胚发育到E12时存活率达到35％,与原装电极相比分别提高48.3％和600％个百分点.结论 自制电极在鸡胚视顶盖电转过程对胚胎的损伤小,转染后胚胎成活率高,为鸡胚视顶盖电转基因提供一种高效的转染技术.
