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单纯疱疹病毒Ⅱ型PCR检测引物设计及其价值探讨
生殖器疱疹(GH)大多是由单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染所致.主要通过性接触传播.其发病率迅速上升,成为人们关注的公共卫生问题[1].现今生殖器疱疹不典型表现和无症状感染相当多见[2].建立一种快速、简便、特异的检测HSV-2的方法很有必要.糖蛋白D(gD)为HSV-2主要的激活机体免疫的抗原,本试验针对HSV-2糖蛋白D基因序列设计引物并扩增的片断,均符合进一步克隆重组载体表达的要求,所以为研究HSV-2基因疫苗提供了有利的条件.现将结果总结如下.
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变形链球菌基因疫苗pcDNA3-gtfB鼻黏膜免疫家兔的实验研究
组.
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郑州铁路职工HBsAg携带率调查及乙肝血源疫苗和基因疫苗免疫效果比较
目的掌握郑州地区铁路职工HBsAg携带情况及乙肝疫苗免疫效果.方法ELISA法检测HBsAg;随机分两组进行乙肝血源疫苗和基因疫苗接种,观察对比两种疫苗免疫效果.结果HBsAg携带率为7.05%(40/567),低于全国10%的平均水平.527名职工接种乙肝血源疫苗和乙肝基因疫苗比较调查,显示两种疫苗的抗-HBs阳转率无显著性差异,但在性别上阳转率均有差异.结论女性抗-HBs阳转率明显高于男性.即女性接种乙肝疫苗后更易获得保护性抗体.
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融合基因S2S/IFNα对小鼠免疫反应的影响
目的 探讨S2S/IFNα融合基因疫苗诱导HBV preS2S特异性体液免疫及细胞免疫应答的作用.方法 pcDNA3.1S2S/IFNα作为实验组,设立pcDNA3.1S2S+pcDNA3IFNα组、pcDNA3.1S25组及空载体对照组作为对照组,免疫BALB/c小鼠.采用0、2、4周的方案接种,检测各次接种后抗体水平.初次免疫后7周,测定免疫脾细胞的杀伤活性、增殖活性、细胞因子的分泌水平及免疫脾细胞CD25的表达量.结果 pcDNA3.1S2S/IFNα组小鼠抗体滴度、免疫脾细胞的杀伤活性和增殖活性、Th1型细胞因子的分泌水平及CD25表达量均比对照组明显增强.结论 S2S/IFNα融合基因能诱导更强的特异性体液免疫及细胞免疫应答.
关键词： S2S/IFNα融合基因 基因疫苗 -
核酸疫苗对慢性乙型肝炎病毒感染的治疗作用
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重危害人类健康的疾病,目前尚无理想的治疗药物.核酸疫苗(基因疫苗)是有希望的治疗措施之一.
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人巨细胞病毒pp65基因疫苗的研制
目的 探讨人巨细胞病毒( HCMV)基因疫苗的研制及其预防和治疗HCMV原发和再发感染的效果.方法 应用聚合酶链式反应(PCR)扩增HCMV pp65基因全长、巨细胞病毒(CMV)启动子的上下游序列,转化至质粒并载体,测序;合成分泌肽基因,构建自制的含CMV启动子、pp65基因和分泌肽基因的pcDNA 5.0转染载体,即HCMV pp65基因疫苗.将该载体疫苗通过脂质转染法转至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,Western点杂交检测CHO细胞上清中pp65蛋白.结果 克隆pp65基因全长测序结果与HCMV AD169株上的pp65标准序列比较:一致性为99.99%.构建了含有分泌肽、CMV启动子(含有增强子和内含子) 和pp65全长pcDNA 5.0的转染载体,即HCMV基因疫苗.转染至CHO 细胞,其上清培养提取物Western点杂交阳性.结论 含有分泌肽、CMV启动子和pp65cDNA的pcDNA 5.0真核载体即粗制的HCMV 基因疫苗可成功构建.
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NIH3T3细胞及小鼠骨骼肌中人PH-20基因疫苗的表达
目的:研究人PH-20基因疫苗在体内外的表达.方法:以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1(+)-hPH-20基因疫苗导入MH3T3细胞中,RT-PCR和原位杂交检测hPH-20 mRNA的表达.以脂质体介导基因转染法将疫苗接种于BALB/C小鼠后腿股内侧肌,分别于接种后第4、7、11、16天取小鼠股内侧肌进行RT-PCR检测.结果:体外转染的NIH3T3细胞阳性克隆经RT-PCR检测,可见1530 bp目的条带;原位杂交结果显示阳性细胞胞浆中可见蓝紫色颗粒.取注射基因疫苗后的小鼠注射部位肌肉以RT-PCR法检测到1 530 bp的目的条带,空载体及生理盐水对照组未见目的条带.结论:人PH-20基因疫苗体内外均可表达.
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基因枪介导人精子顶体膜相关蛋白32基因疫苗在小鼠骨骼肌中的表达
目的:观察pcDNA3.1(+)-人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)基因疫苗经基因枪介导肌肉接种后在小鼠体内的表达.方法:BALB/c雌性小鼠6只,实验组鼠(4只)经后腿股内侧肌以基因枪多点注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hSAMP32 5μg,空载体对照组(1只)注射pcDNA3.1(+)载体5 μg,空白对照组(1只)注射无菌生理盐水200μl.接种后第7 d取小鼠股内侧肌注射部位肌肉,RT-PCR和原位杂交法检测目的基因mRNA的表达,以自制抗血清进行免疫组织化学染色检测目的基因蛋白的表达.取小鼠心、肝、脾、脑、肾、胚胎组织,PCR扩增,行基因疫苗的安全性检测.结果:RT-PCR和原位杂交检测结果显示实验组小鼠注射部位肌肉组织有目的基因及其蛋白的表达,对照组未见表达.实验组小鼠心、肝、脾、脑、肾、胚胎的基因组DNA均未扩增出目的基因条带,说明外源性基因没有整合到宿主染色体.结论:该基因疫苗可在小鼠骨骼肌内有效、安全地表达.
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VR1012-TCRγV1真核表达载体的构建
目的:构建含TCRγV1基因的重组表达载体.方法:从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA克隆入VR1012质粒;转化感受态细菌E.Coli DH5e,以通用引物PCR扩增筛选阳性克隆,并双酶切鉴定;小量提取质粒进行测序.结果:测序结果证实重组载体中的外源片段序列与GenBank中TCRγV1序列完全相符.结论:成功构建了含TCRγV1基因的重组表达载体.
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pcDNA3/TCRγV1真核表达载体的构建及表达
目的:构建含TCRγV1基因的真核表达质粒并检测其在小鼠骨骼肌中的表达.方法:从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取RNA,用RT-PCR法扩增含BamH Ⅰ与HindⅢ酶切位点的TCRγV1基因序列,将TCRγV1基因PCR产物插入pcDNA3后转化到大肠杆菌DH5α,阳性克隆酶切鉴定后测序分析.大量提取质粒,股四头肌注射法免疫小鼠,RT-PCR法检测小鼠肌肉中TCRγV1mRNA的表达.结果与结论:pcDNA3/TCRγV1重组质粒构建成功,并能在小鼠骨骼肌中表达.
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IL-2/pUC19重组质粒的构建
目的:构建IL-2/pUC19重组质粒.方法:从PHA刺激的人Jurkat 细胞中提取mRNA,经RT-PCR法获取IL-2 基因;将克隆质粒pUC19和IL-2 基因行BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5а感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定.结果:电泳获得预期的IL-2 条带,测序证实为正确的IL-2序列. 结论:应用克隆质粒pUC19可方便高效地构建IL-2/pUC19重组质粒.
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肿瘤基因疫苗研究取得初步进展
肿瘤基因疫苗是近年来国内外研究的热点,它主要通过激活患者自身免疫系统,以达到清除或控制肿瘤的目的.短短几年间,肿瘤基因疫苗的研制在实验室和临床前研究,甚至Ⅰ期及Ⅱ期临床试验中均取得了可喜的成果,显示出广阔的应用前景.南开大学的向荣教授和来自美国国立肿瘤研究所的Gul1ey教授分别报告了他们在肿瘤基因疫苗研制中取得的成果.
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Th1类细胞因子对pHCV-C重组体诱生免疫应答的增强作用
为了探索Th1类细胞因子IL-2和IL-12对含丙型肝炎病毒(HCV)核心(C)基因重组体诱生的免疫应答的增强作用，本文构建了包含HCV C基因片段的重组质粒pHCV-C，将其单独或与Th1类细胞因子表达质粒pIL-2或pIL-12共免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测免疫小鼠血清中的HCV C特异性抗体滴度；以pHCV-C转染SP2/0细胞，经筛选稳定表达HCV C抗原者(SP2/0-HCV-C)为靶细胞，51Cr释放试验检测细胞毒T淋巴细胞(CTLs)的体外特异性杀伤功能。结果发现，pIL-2能够增加pHCV-C诱导的抗体产生，对CTLs的杀伤作用增强却不明显；而pIL-12对pHCV-C诱导的抗体和细胞免疫应答均有增强作用(p＜0.05)。由此推断，佐以Th1类细胞因子，不仅可以增强基因疫苗诱生的免疫应答强度，而且可能使机体对基因疫苗的免疫应答朝着有利于优先诱导CTLs免疫应答清除病原体的方向发展。
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猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究
构建了猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)主要保护性抗原E2基因4种不同的真核表达质粒.小鼠免疫试验表明,E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响,有信号肽序列的E2基因可诱导产生特异性免疫反应,且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强,而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CSFV特异性的免疫反应.攻毒保护试验表明,免疫家兔少可抵抗10个小感染剂量(MID)的猪瘟兔化弱毒苗(Hog cholera lap-inized virus, HCLV)的攻击;免疫猪可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击.
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丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因DNA疫苗的构建及动物免疫试验
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)主要通过输血传播,可以导致多种临床型的肝炎及其它肝脏疾病,包括肝硬化及肝细胞癌[1,2].目前尚无一种有效的抗HCV的措施,这使人们把眼光放到该病的预防上,DNA疫苗的产生为研制丙型肝炎(丙肝)的预防及治疗性疫苗提供了新的思路.
关键词： 丙型肝炎病毒(HCV) 蘘膜蛋白 基因疫苗 瞬时表达 -
乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答
乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国常见病及多发病.HBV难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍.目前虽然基因重组HBV表面抗原(HBsAg)疫苗预防HBV感染取得了较好的效果,但基因重组HBsAg疫苗主要能诱导特异性体液免疫,不能刺激机体的细胞免疫应答.近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2].为了探讨应用HBV基因疫苗预防HBV感染的可能性,本文构建了HBV全S基因和HBsAg基因疫苗,观察和比较了这两种疫苗经肌肉注射接种到Balb/C小鼠体内后的细胞及体液免疫功能的变化.
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人 SART 3 基因疫苗对荷瘤小鼠的免疫杀伤作用
目的 研究表达人T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART 3)基因的DNA疫苗在小鼠体内对表达该基因肿瘤细胞的免疫杀伤作用.方法 构建表达人SART 3基因的C3H小鼠骨肉瘤细胞LM 8-SART 3,将其接种到C3H小鼠成瘤,比较疫苗治疗组和空载体对照组中肿瘤的生长情况,取小鼠淋巴细胞检测免疫反应活性并行病理切片镜下比较.结果 荷瘤小鼠经疫苗注射后肿瘤生长延缓,免疫反应活性与淋巴细胞数量有关,镜下可见肿瘤细胞坏死并淋巴细胞浸润.结论 表达人SART 3基因的DNA疫苗能诱导小鼠免疫杀伤肿瘤细胞,抑制表达该基因的肿瘤细胞在小鼠体内生长.
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乙型肝炎病毒基因疫苗诱导小鼠产生免疫应答的效应
目的:构建编码乙型肝炎病毒(HBV)表面蛋白S的重组质粒pCR 3.1-S,将之直接肌肉注射bal b/c小鼠,观察小鼠HBV特异的免疫应答.方法:以ELISA法检测小鼠血清,3H-TdR掺入法测定淋巴细胞增殖,51Cr4 h释放法检测淋巴细胞杀伤功能.结果:与空载体对照组相比较,基因疫苗诱发小鼠产生良好的抗HRs反应及HBV特异的细胞免疫应答(P＜0.05).结论:基因疫苗pCR 3.1-S可诱导bal b/c小鼠产生全面的免疫应答.
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白细胞介素2作为佐剂增强乙型肝炎病毒基因疫苗诱导的免疫应答
目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)基因疫苗pCR3.1-S,观察重组人白细胞介素2(rhIL-2)作为佐剂对其诱导BALB/c小鼠产生免疫应答的影响.方法:以EUSA法检测免疫小鼠血清抗HBs抗体,另用3H-TdR掺人法测定淋巴细胞增殖活性,初步研究不同组的体液和细胞免疫应答.结果:rhIL-2组免疫小鼠抗HBs抗体和淋巴细胞增殖活性与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论;HBV基因疫苗可诱发BALB/c小鼠产生良好的免疫应答,rhIL-2作为佐剂可增强其免疫效应.
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异黏蛋白/星形细胞上调基因-1靶点的基因疫苗诱导免疫抑制小鼠前列腺癌生长及转移
目的 观察以异黏蛋白(MTDH)/星形细胞上调基因-1(AEG-1)为靶点的基因疫苗诱导免疫抑制小鼠前列腺癌生长、转移的作用.方法 将C57BL/6雄性小鼠(6～8周龄)随机分为3组(n=20),分别给予磷酸盐缓冲液(PBS)、Pub、Pub-MTDH/AEG-1的减毒沙门氏菌(1×108cfu)灌胃饲服免疫；每周免疫1次,共3次.后1次免疫后1周,在3组小鼠前列腺原位(左、右背侧叶)接种105 RM-1细胞构建前列腺原位移植瘤模型,诱导自发盆腔、腹膜后淋巴结转移；记录各组小鼠肿瘤大小及盆腔、腹膜后淋巴结转移数[以苏木素-伊红(HE)染色为准],通过免疫组织化学方法检测原位肿瘤中CD8、血管内皮生长因子(VEGF)、淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)的表达、用原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测肿瘤细胞凋亡.结果 pUb-MTDH/AEG-1DNA疫苗组与Pub、PBS组比较能显著激发CD8+T细胞及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应；有效抑制小鼠原位前列腺癌生长,MTDH组肿瘤体积(0.248 ±0.102)明显小于Pub组(1.475 ±0.314) (P ＜0.01)；两组小鼠盆腔、腹膜后淋巴结转移率分别为77.78％ 、35.7％(P＜0.05)；并显著增强原位肿瘤中CD8+分子的表达:MTDH组3.56±0.85、Pub组5.12±0.90 (P＜ 0.05),促进肿瘤细胞凋亡:MTDH组(39.60±3.28)％、Pub组(16.18±2.52)％(P＜0.01).结论 MTDH/AEG-1为靶点的基因疫苗在小鼠预防免疫模型中,能有效诱导机体特异性免疫应答,增强细胞免疫及体液免疫,抑制前列腺癌增殖、侵袭,促进肿瘤细胞凋亡,延长荷瘤小鼠生存时间.
关键词： 异黏蛋白/星形细胞上调基因-1 基因疫苗 前列腺癌 转移
