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HSV-1糖蛋白B基因疫苗体内表达的观察
目的 利用单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白B基因疫苗(pgB)免疫小鼠,观察pgB在小鼠体内的表达.方法 利用pgB肌肉接种方法免疫小鼠,通过免疫组化法检测免疫后2、4、6 w pgB在眼、三叉神经、脑表达HSV-1 gB情况.结果 免疫后第2、4、6 w均可见视网膜、三叉神经节、脑组织中大部分细胞核呈棕黄色,免疫组化呈阳性.结论 经肌肉免疫pgB能持续、稳定地在视网膜、三叉神经节、脑组织细胞中表达.
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天冬氨酸节枝的聚乙烯亚胺作为基因疫苗载体的体外评价
[目的]体外评价天冬氨酸节枝的聚乙烯亚胺(AEP-g-PEI)作为非典型性肺炎基因(SARSS DNA)传递载体的可行性.[方法]采用透射电子显微镜及粒径测定仪对由AEP-g-PEI和SARS S DNA形成的复合物(AEP-g-PEI/SARS S DNA)的形态及粒径进行观察和测定;采用MTT法评价AEP-g-PEI的细胞毒性;琼脂糖凝胶电泳法观察SARS S DNA疫苗的压缩及保护能力;采用Western blot法检测AEP-g-PEI与SARS S DNA在细胞内对刺突糖蛋白的表达情况.[结果]AEP-g-PEI和SARS S DNA疫苗形成较为紧密的纳米级球形粒子,可保护SARS SDNA疫苗免受DNA降解酶的降解.在相同质量浓度下,AEP-g-PEI在A549细胞和COS-7细胞中的细胞毒性均低于聚乙烯亚胺(分子质量25 ku).Western blot实验结果表明,在MCF7细胞内可检测到SARS S DNA疫苗所编码的刺突糖蛋白.[结论]高分子AEP-g-PEI作为SARS S DNA的传递载体具有可行性.
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丙型肝炎病毒NS3基因疫苗质粒的构建、表达及其体液免疫应答
目的 构建基于Ii分子的丙型肝炎病毒(HCV)内源性靶向基因疫苗质粒,并检测其在真核细胞中的表达及免疫小鼠诱导的体液免疫应答.方法 通过3轮PCR,以HCV-NS3的Th1表位(1248～1261aa)取代Ii链CLIP片段编码基因,构建基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗质粒,转染COS-7细胞,RT-PCR法检测其在mRNA水平的表达;用内源性靶向基因疫苗pHCV-NS3-Th1和非靶向基因疫苗pHCV-NS3经股四头肌肌肉免疫BALB/c小鼠,以生理盐水、pCI-neo和pCI-neo-Ii作为对照,检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 转染细胞中,内源性靶向基因疫苗质粒在mRNA水平获得表达;对BALB/c小鼠的免疫结果显示,只有pHCV-NS3组小鼠可以检测到针对HCV-NS3的特异性抗体,抗体滴度可达1∶1 024.结论 已成功构建了基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗质粒,其能够在真核细胞中表达,但不能刺激小鼠产生HCV-NS3特异性抗体.
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P-糖蛋白基因疫苗的构建与鉴定
目的制备P-糖蛋白基因疫苗.方法利用PCR方法扩增编码人类P-糖蛋白多药耐药基因序列胞外区约1kb片段,与真核表达载体pcDNA3进行定向重组,限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切反应及测序鉴定该重组基因疫苗,磷酸钙共沉淀法转染人类K562红白血病细胞,经G418筛选后,免疫组化分析该重组基因疫苗表达产物的抗原特异性.结果构建了pcDNA3-MDR1重组基因疫苗.限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切分别显示5.4kb的载体片段及约1kb的插入序列,测序948个碱基中除2个碱基突变外均与原序列排列相符.免疫组化方法证实细胞膜表面MDR1约1kb片段的表达产物可被抗Pgp抗体识别.结论构建的pcDNA3-MDR1重组基因疫苗可被市售的Pgp抗体特异性识别,具有Pgp抗原特异性.
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基因疫苗用质粒DNA生产下游工程的概述
基因治疗的研究和基因疫苗的开发被认为是人类医学史上的两大突破.第一批基因治疗药品很快将要面市,预计到2010年,此类药品的市场收益将达到45 000 000$[1].
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淋病奈瑟菌表面蛋白A基因真核表达质粒诱导的小鼠特异性体液免疫应答
目的 观察淋病奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)基因真核表达质粒不同免疫途径诱导的小鼠特异性体液免疫应答效果.方法 将NspA基因真核表达质粒pcNspA通过肌肉、滴鼻和阴道3种途径免疫BALB/c小鼠,分别于0、2、3、4周各免疫1次,末次免疫后2周,收集各组小鼠血清、支气管肺泡洗液和阴道洗液,采用间接ELISA方法检测特异性抗体效价;并检测抗体介导的补体溶菌活性.结果 滴鼻免疫和肌肉免疫pcNspA质粒均可诱导小鼠体内产生较高水平的特异性IgG和IgA抗体,而且滴鼻免疫组在支气管肺泡洗液和阴道洗液中均可检测到特异性sIgA抗体,而阴道免疫组仅在阴道局部检测到较低水平的特异性sIgA抗体;滴鼻免疫组小鼠血清具有溶菌活性.结论 淋病奈瑟菌NspA基因真核表达质粒可诱导小鼠体内产生特异性抗体,并具有抗菌活性;滴鼻免疫可能是其更有效的免疫途径.
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单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白B基因疫苗对HSV-1原发及潜伏感染的抑制作用
目的 观察单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)糖蛋白B基因疫苗(pgB)在防治HSV-1原发及潜伏感染的作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为4组:A组(实验组,注射含质粒pgB的PBS)、B组(阳性对照组,注射灭活的HSV-1病毒液)、C组(载体对照组,注射含质粒pcDNA3的PBS)和D组(空白对照组,注射PBS).各组小鼠均于双侧股四头肌多点注射,共免疫3次,间隔3周.于末次免疫3周后行角膜划痕接种HSV-1.术后1～ 14、21和28 d行角膜荧光素染色,在裂隙灯显微镜下观察角膜炎病变形成情况.角膜接种病毒第30天,处死全部小鼠,取三叉神经节,接种Vero细胞,观察病毒潜伏感染形成情况.结果 A组和B组小鼠接种HSV-1后仅有轻度角膜上皮炎发生,且6d内全部愈合,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组和D组小鼠接种后第2天角膜上皮炎达到高峰,7d后炎症慢慢消失,与A组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).A组和B组小鼠接种后未发生角膜基质炎,且无1例死亡;C组和D组小鼠在接种后第5天出现炎症反应,并逐渐加重,接种后11～14 d角膜基质炎达到高峰,在接种后第30天有30％小鼠死亡.Vero细胞检测病毒潜伏感染,A组和B组未发生细胞病变,而C组和D组第5天发生细胞病变.结论 pgB能有效预防实验小鼠HSV-1原发感染,并抑制潜伏感染的形成.
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浅谈我国乙型肝炎免疫预防的效果
我国乙型肝炎的免疫预防经历了应用血源疫苗和基因疫苗两个阶段.由于血源性乙肝疫苗用HBsAg携带者血浆做原料,也有着不可克服的缺点,故第一代疫苗(血源性乙肝疫苗)为一种过渡性疫苗,它必然被第二代乙肝疫苗(基因工程乙肝疫苗)所代替,目前我国已经停止生产和使用血源性疫苗.
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019热休克蛋白70在免疫中的作用及应用
热休克蛋白(heat shock protein,hsp)是生物体在应激条件下产生的一组蛋白,在正常细胞中也广泛存在.其中hsp70具有多种功能,在免疫中机体对hsp70有4种作用模式;hsp70不仅可作为免疫佐剂、抗原载体,而且在基因疫苗中也显示出诱人的前景.
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肿瘤基因疫苗的研究进展
近,美国FDA批准上市了第一个肿瘤治疗性疫苗,成为肿瘤治疗史上的一个里程碑事件.肿瘤免疫治疗领域目前正朝着发展新型疫苗技术方向前进,理想的肿瘤疫苗应该可以产生强大、持久和有效的免疫反应,同时疫苗的制造成本低廉,可以形成标准化生产工艺.本文中所提及的基因疫苗是在肿瘤多种免疫治疗方式中新出现的一种治疗方法.多项研究已经证明,肿瘤免疫基因治疗方式可以产生有效的免疫反应,获得很好的临床效果.在本综述中,我们简要概述当前肿瘤基因疫苗的发展现状及新研究进展,探讨肿瘤基因疫苗的未来发展趋势.
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柯萨奇病毒B组3型基因疫苗预防实验性心肌炎的研究
目的以构建的柯萨奇病毒B组3型(CVB3)VP1基因的真核表达系统pCEP4-CVB3VP1作为基因疫苗,评价其对CVB3实验性心肌炎的预防作用.方法大量制备pCEP4-CVB3VP1,提纯后将其接种BALB/C小鼠,取血清进行ELISA、病毒中和试验和病毒攻击保护实验.结果 ELISA证明pCEP4-CVB3VP1表达产物可刺激机体产生抗CVB3的特异性IgM;病毒中和试验证明其可诱导机体产生中和抗体,中和CVB3毒力;病毒攻击保护实验证明其可保护接种小鼠抵抗CVB3攻击.结论pCEP4-CVB3VP1能诱导机体产生免疫应答,可作为基因疫苗预防CVB3心肌炎.
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肿瘤基因疫苗
肿瘤是困扰人类已久的顽疾,有关于肿瘤治疗方法的研究也日趋深入.近年来,随着生物学技术的发展,特别是细胞工程和基因工程技术的发展,肿瘤抗原的基因结构和人工合成技术也取得了相应进展,这也使得肿瘤基因疫苗成了众多学者研究的热点.
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抗病毒基因治疗的新技术
以转基因置换和靶基因表达为特征的基因疗法,在某些遗传疾病和恶性肿瘤的治疗中已显示良好的前景.近年来,病毒基因治疗的研究也取得了很大的进展,除了反义基因治疗、基因疫苗、显性失活突变体、单链抗体外,还出现了如RNA干扰等新的基因技术.本文就病毒性疾病基因治疗的策略及研究现状进行综述.
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黑色素瘤抗原A3基因对肝细胞癌免疫保护作用
目的:构建小鼠黑色素瘤抗原A3 (MAGE-A3)基因真核表达载体,观察其对小鼠肝细胞癌的免疫保护作用.方法:化学合成小鼠MAGE-A3全长基因,以pcDNA3.1(+)质粒为载体,构建重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-A.将pcDNA3.1(+)-MAGE-A3载体转染293T细胞,免疫印迹鉴定转染细胞MAGE-A3蛋白的表达.将纯化的重组质粒DNA肌肉注射免疫小鼠,5-Aza-Cdr诱导小鼠肝癌细胞H22表达MAGE-A3基因,观察小鼠成瘤情况与瘤体形态学改变.结果:成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染293T细胞后能正常高效表达MAGE-A3蛋白;MAGE-A3重组质粒DNA免疫小鼠后,小鼠成瘤的时间推迟,瘤体生长速度明显减慢,瘤体大小和质量与对照组相比,差异有统计学意义;光镜下显示MAGE-A3重组质粒组肿瘤细胞排列较为稀疏,间质炎症细胞浸润和淋巴细胞增殖更为明显.结论:MAGE-A3基因免疫可有效抑制肝细胞癌成瘤,产生对肝癌的免疫保护作用,提示MAGE-A3基因疫苗可作为肝癌防治手段之一.
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hPH-20 DNA 疫苗对雌性小鼠生育的影响
目的:观察 pcDNA3.1(+)-hPH-20 基因疫苗经基因枪介导肌肉接种后在小鼠体内的表达及对小鼠受孕率的影响.方法:以小鼠为实验材料,将实验组经后腿股内侧肌以基因枪多点注射重组质粒 pcDNA3.1(+)-hPH-20 5μg,空载体对照组注射 pcDNA3.1(+)5μg,空白对照组注射生理盐水 200μl,于接种后取股内侧肌检测 hPH-20 mRNA 和蛋白的表达.采集抗血清做人精子穿去透明带仓鼠卵细胞实验,动物合笼观察受孕情况,持续 4 个月后进行基因疫苗的安全性检测.结果:注射部佗肌肉检测到目的条带;原位杂交在肌细胞膜、胞质和部分肌细胞核可见到蓝紫色颗粒;免疫组织化学显色在肌细胞膜和胞质可见到棕褐色颗粒;实验组小鼠受孕率和对照组相比下降77.78%,同时用鼠抗 hPH-20 血清能明显降低精子穿卵率;外源性基因没有整合至宿主染色体.结论:hPH-20 基因疫苗经基因枪介导肌内接种有一定的免疫避孕效果.
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壳聚糖递送的结核基因疫苗诱导的肺部黏膜免疫及在抗结核免疫保护中的意义
诱导肺局部黏膜免疫对于早期控制结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberfulosis)十分关键.在我们过去构建的结核基因疫苗pHSP65pep有效诱导脾脏IFN-γ+Th1细胞应答的基础上,为更好诱导呼吸道和肺局部黏膜免疫,采用天然生物多糖壳聚糖(chitosan)作为黏膜递送介质递送结核基因疫苗.制备壳聚糖-pHSP65pep结核黏膜疫苗,滴鼻免疫BALB/c小鼠,检测全身和黏膜T细胞免疫及抗体应答;并以大剂量BCG攻毒,以肺脏HE染色及菌落计数检测免疫保护效果.结果显示,壳聚糖黏膜递送虽不能增加血清HSP65特异性IgG抗体产生,但显著提高了肺灌洗液的SIgA水平;同时显著增强了肺黏膜局部pHSP65pep疫苗诱导的IFN-γ+CD4+Th1细胞应答.攻毒结果证实,壳聚糖递送显著增强了结核基因疫苗的免疫保护效果.表明壳聚糖黏膜递送可显著增强结核基因疫苗诱导的特异性肺黏膜Th1应答和SIgA水平,提高免疫保护效果.提示呼吸道黏膜免疫对于结核保护性免疫具有关键意义.
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C家族趋化因子XCL 1增强CVB3基因疫苗的抗病毒免疫应答及保护作用
为提高以往构建的基因疫苗pcDNA3.1-VP1的抗B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染的免疫效果,以编码C家族趋化因子XCL1的质粒pcDNA3.1-XCL1共注射,观察诱导的CVB3特异性免疫应答及CVB3病毒性心肌炎预防效果.将两种质粒各50μg混合后分别于0、2、4、6周肌注免疫小鼠4次,末次免疫后4周分别以5×LD50剂量CVB3攻击小鼠观察保护率,或以3×LD50剂量CVB3感染小鼠观察病毒性心肌炎的诱生.结果显示,与单纯pcDNA3.1-VP1质粒相比,XCL1质粒共注射可增强血清CVB3特异性IgG以及特异性CTL应答.5×LD50病毒攻击后,共注射组体重降低7.28%,而pcDNA3.1-VP1组体重降低10.97%;共注射组28 d保护率达40%,高于pcDNA3.1-VP1组的30%.3×LD50病毒感染后心肌组织病理显示,共注射组心外膜下仅有轻微炎症,心肌内未见炎症细胞浸润,而pcDNA3.1-VP1组除心外膜下有较多淋巴细胞聚集外,心肌内有少量炎症浸润和坏死灶.提示XCL1质粒共注射可增强CVB3特异性体液和细胞免疫应答及抗病毒保护,可有效预防病毒性心肌炎的发生.
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hCGβ-C3d3基因免疫BALB/c小鼠选择性促进B细胞克隆扩增
评价分子佐剂C3d在基因免疫中选择性促进抗原特异性B细胞增殖作用.分别用质粒pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ免疫BALB/c小鼠,免疫剂量为50 pmol.间隔3周相同剂量加强免疫1次.加强免疫后第1周及第2周,MTT法分析各组小鼠脾脏B细胞和T细胞增殖;ELISPOT法分析两免疫组小鼠脾脏hCGβ抗原特异性IgG分泌细胞.结果显示在加强免疫后第1周及第2周,hCGβ-C3d3免疫组B细胞增殖能力显著高于hCGβ免疫组及正常对照组;而各组间T细胞增殖状况未见明显差异.hCGβ-C3d3免疫组较hCGβ免疫组小鼠脾细胞分泌IgG的量和分泌hCGβ抗体的细胞数量均明显增加.结果表明分子佐剂C3d对于B细胞具有选择性克隆扩增作用.
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结核Mtb8.4基因疫苗对结核杆菌感染小鼠的免疫保护效果研究
为研究Mtb8.4基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果,将雌性C57BL/6N小鼠32只,随机分为4组,即Mtb8.4基因疫苗组、BCG组、pcDNA3.1(+)组和PBS组.小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平;并按效靶比例分别为100:1、50:1、10:1进行CTL杀伤活性检测.用结核杆菌H37Rv强毒株静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.结果表明,Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,特异性CTL活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻.
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B细胞表位基因疫苗诱导特异性免疫应答及特性研究
为研究特异性B细胞表位短肽为基础的DNA疫苗的免疫应答特性,将鸭乙肝病毒Pre-S中的P127-138 B细胞表位基因克隆到含多肽表达盒(peptide expression cassette,PEC)的载体中,体外转染C2C12肌肉细胞,用DOT-EIA检测表位短肽的表达,进一步分别免疫不同品系的BALB/c和C57BL/6小鼠,比较MHC限制性对免疫应答的影响.结果表明,重组pECk-b1b2载体可在体外瞬时高效表达,并保持原有的免疫活性;体内基因免疫能诱导针对表位短肽的特异性抗体;不同品系小鼠抗体产生动力学相似,但抗体滴度差异显著.这些结果提示,以B细胞表位为基础的基因免疫可诱导特异性免疫应答,为DNA疫苗的分子设计提供了新的思路和应用前景.
