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影响聚乙烯亚胺体外转染细胞效率的因素研究
将外源基因导入真核细胞是分子生物学研究中的一项重要技术。转基因载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体系统转染效率高，是体内基因治疗的主要工具，但安全性存在隐患，且有免疫原性，体内不能反复应用，制备较复杂，而且所能装载的外源DNA大小有限，使其应用受到很大限制。
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肝素结合改良医用聚氯乙烯材料的细胞毒性评价
目的评价肝素结合改良聚氯乙烯材料的细胞毒性及临床应用安全性.方法对肝素结合改良聚氯乙烯、改良聚氯乙烯等材料进行体外细胞培养,通过四甲基偶氮唑盐比色(MTT)实验观察细胞的活性和相对增殖率.结果改良聚氯乙烯及肝素结合的改良聚氯乙烯在吸光度及细胞的相对增殖率方面,结果优于传统聚氯乙烯材料;MTT实验表明肝素结合方法未改变材料的相对增殖率.结论改良聚氯乙烯及肝素结合的改良聚氯乙烯较传统材料相比,具有更优的细胞相容性,毒性轻微,可安全应用于临床.
关键词： 聚乙烯亚胺 聚氯乙烯 细胞毒性 四甲基偶氮唑盐比色法 -
磁性纳米颗粒与脂质体介导REST-siRNA转染hADSCs的比较
目的 对聚乙烯亚胺包被的磁纳米颗粒(PEI-SPIO)与脂质体(lipofectamineTM 2000)作为基因载体转染人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的可行性及转染后细胞的增殖、转染效率及基因瞬时干扰效率进行比较分析.方法 分别将PEI-SPIO和lipofectamineTM 2000作为基因载体连接REST-siRNA体外转染hADSCs,用MTT法检测hADSCs增殖和功能;用荧光显微镜观察转染效率;分别用Real-time PCR和Western blot检测REST的表达.结果 用磁性纳米颗粒和脂质体作为基因载体转染细胞后,细胞成活率分别为99％和79％ (P ＜0.05);磁纳米颗粒和脂质体的转染效率无差异,分别为75％和71％;磁纳米颗粒和脂质体作为基因载体时RNA表达量分别为(0.46±0.04)和(0.53±0.05),蛋白水平表达量分别为(0.501 ±0.006)和(0.523 ±0.004).结论 磁性纳米颗粒因其具有低细胞毒性可代替脂质体作为转染干细胞的基因载体.
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两种非病毒载体介导microRNA转染的对比
microRNA作为核酸类药物,在细胞和生物体内存在稳定性差,半衰期短,转染效率低,靶向性差[1],故转染过程需要高效、高安全性的载体.Lipofectamine是常用的转染脂质体,可与 DNA形成复合物,有较强的转染能力.聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)属阳离子聚合物,在体内外均有较高的转染效率,不良反应较低[2].选择适合的小分子RNA基因载体对其后续研究至关重要.本研究分别选择了脂质体lipofectamin2000和阳离子聚合物PEI作为microRNA的转染载体,在体外检测其在悬浮细胞THP-1中的转染效率和细胞死亡率,比较两种转染载体的转染特性及作为microRNA基因载体的可行性.
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聚乙烯亚胺包被的Fe3O4磁纳米颗粒对hAMSCs生物特性的影响
目的 探讨聚乙烯亚胺(PEI)包被的超顺磁性氧化铁(SPIO)标记人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的佳方法并检测hAMSCs的增殖.方法 分别用含铁浓度为6、8、10和12 mg/L的PEI-SPIO标记体外培养的hAMSCs,利用普鲁士蓝染色法和原子吸收分光光度法对PEI-SPIO的标记情况进行分析鉴定,将未标记组设为对照组；应用MTT法检测PEI-SPIO标记后hAMSCs的增殖活性.结果 hAMSCs经PEI-SPIO标记后,细胞内可检测到大量铁颗粒.PEI-SPIO标记具有浓度依赖性；10和12 mg/L浓度的PEI-SPIO明显抑制细胞增殖活力(P＜0.05).结论 浓度为8 mg/L的PEI-SPIO标记hAMSCs可获得良好的标记效果,并且不影响细胞的增殖活力.
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聚乙烯亚胺包被的Fe3O4磁纳米颗粒对hADSCs生物学特性的影响
目的 探讨聚乙烯亚胺(PEI)包被的超顺磁性氧化铁(spIo)对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)生物学特性的影响.方法 从人皮下脂肪组织中分离、培养hADSCs并鉴定,选取第3代hADSCs,分别用含铁浓度为6、8、10和12 mg/L的DMEM/F12培养液共孵育.通过普鲁士蓝染色、MTT细胞增殖实验、锥虫蓝染色及多向分化诱导实验来探讨PEI-SPIO标记后,hADSCs的标记能力、细胞增殖和分化能力.结果 1)当铁终浓度为8、10和12 mg/L时,PEI-SPIO对hADSCs的标记率为99％,当铁终浓度＜8 mg/L时,PEI-SPIO对hADSCs的标记率为96％.2)当铁终浓度为6和8 mg/L时,PEI-SPIO标记的hADSCs的活细胞比率为99％,而当铁终浓度为10和12 mg/L时,活细胞比率为(79.03±2.25)％和(70.23±1.36)％,显著低于对照组(P＜0.01).3)当铁浓度为10和12 mg/L时,在诱导hADSCs分化过程中,细胞绝大多数死亡.结论 铁浓度8 mg/L为PEI-SPIO标记的适宜浓度,既能高效的标记hADSCs,又不影响hADSCs的细胞增殖、多向分化能力等生物学特性.
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聚乙烯亚胺对小鼠组织器官氧化损伤的研究
目的 光化学法制备一系列不同粒径的聚乙烯亚胺纳米凝胶(polyethylenimine,PEI),并研究其在小鼠体内对组织器官的氧化损伤情况及其影响因素.方法 PEI单体在紫外光照射下引发聚合,生成粒径分布较窄且粒径可控的高分子纳米凝胶,并表征.腹腔给予不同剂量的PEI,化学比色法测定小鼠肝脏、肾脏和肺脏组织内GSH和MDA含量及SOD活力.结果 光相干光谱仪检测,PEI纳米凝胶粒径为38nm～200nm;扫描电子显微镜和原子力显微镜下多为球形.大剂量时肝脏、肾脏和肺脏组织的GSH和MDA含量及SOD活力均与对照组有明显差异(P＜0.05),且MDA随PEI的粒径增大而增高,GSH、SOD含量则有相反的趋势;小剂量时各组织器官的GSH和MDA含量及SOD活力与对照组无差别(P＞0.05).结论 大剂量时PEI对小鼠组织器官可造成氧化损伤,PEI的粒径增大其损伤也增加;小剂量分次给予时不明显.MDA的测定和GSH、SOD的测定相互配合,可反映PEI对机体组织器官产生的氧化损伤.
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新型非病毒载体聚乙烯亚胺介导基因转染参数的研究
聚乙烯亚胺是一种新型阳离子多聚物基因释放载体,可结合浓缩DNA,通过粘附内吞,进入细胞,使携带的质粒表达.本研究目的通过对聚乙烯亚胺各种转染参数的测定,为合成以聚乙烯亚胺为骨架的人工载体积累数据.方法:本研究利用聚乙烯亚胺分别结合含β半乳糖甙酶报告基因的pSVβ表达质粒、含绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP质粒转染Cos-7细胞,通过组织化学法测定细胞抽提产物中β半乳糖甙酶的表达量、流式细胞仪法测定绿色荧光蛋白阳性细胞的表达比例,来测定影响转基因效率的各种参数.结果:在培养液中,6μg/ml聚乙烯亚胺作用24h,NIH 3T3细胞生存率为64.2%,7μg/ml聚乙烯亚胺细胞生存率为54.4%.电泳阻滞试验,聚乙烯亚胺在N/P比在3.0以上方可完全结合DNA.溶酶体抑制剂氯喹可增加聚乙烯亚胺的转染效率.培养液中的白蛋白、血清可降低转染效率.作为配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒,HEPES缓冲液优于生理盐水,生理盐水优于5%葡萄糖.配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒中加入Mg2+降低转染效率.聚乙烯亚胺转染效率优于SuperFectTM(断裂型树突状多聚物),而毒性低于SuperFectTM.结论:本研究首次报道了聚乙烯亚胺与DNA结合配伍的N/P比计算公式,N/P=7.75×b/c,这里b是PEI的质量(μg),c是质粒的质量(μg);PEI的工作终浓度应≤6μg/ml.通过体外细胞试验证明,聚乙烯亚胺是一种有效的真核细胞转染剂和人工合成基因载体的骨架.
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烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的初步研究
目的考察烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的安全性和有效性。
方法以1-溴十二烷和分子量为1800的分枝状 PEI （bPEI1.8K）为原料，合成 bPEI1.8K-C12，并用1H-NMR 对其结构进行确认；采用 MTT 法考察 bPEI1.8K-C12的细胞毒性；红细胞溶血实验考察 bPEI1.8K-C12的生物相容性；测定bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的粒径分布和 zeta 电位；采用激光共聚焦显微镜观察 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的细胞摄取行为；采用琼脂糖凝胶阻滞电泳考察 bPEI1.8K-C12对DNA 的固缩能力；并用荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白报告基因考察 bPEI1.8K-C12的体外转染效率。
结果经1H-NMR 确认，成功合成了 bPEI1.8K-C12；MTT结果表明 bPEI1.8K-C12对人乳腺癌 MCF-7细胞的毒性与bPEI1.8K 相当；红细胞溶血实验结果表明高浓度 bPEI1.8K-C12静脉注射时具有潜在溶血性；质量比相同时，bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的平均粒径和 zeta 电位均比相应的bPEI1.8K/DNA 大；烷基化修饰后，bPEI1.8K-C12对 DNA 的固缩能力降低，MCF-7细胞对 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的摄取效率大大增加，bPEI1.8K-C12递送报告基因质粒的体外转染效率显著高于 bPEI1.8K，甚至与 lipofectamine2000相当。
结论 bPEI1.8K-C12是一种安全高效的基因递送载体，具有较高的进一步开发前景。 -
聚乙烯亚胺用作基因转染载体的研究进展
基因载体问题以及与载体相关的免疫反应、细胞毒性和安全性等问题,是基因治疗领域亟待解决的关键问题之一.聚乙烯亚胺(PEI)是阳离子聚合物非病毒载体的典型代表[1],是一种很早便为人所知并予以应用的有机大分子.目前,以PEI阳离子聚合物与DNA形成的PEI/DNA复合物已成为非病毒基因载体的研究热点.本文就近年来这方面的研究进展作简要综述.
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超声辐照联合PEI介导基因转染的实验研究
目的 探讨超声联合聚乙烯亚胺(PEI)在促进肝癌细胞(HepG2)的基因转染中有无协同作用.方法 选用工业用和实验用PEI为研究对象.用锥虫蓝拒染法检测细胞成活率,选取合适的PEI浓度与绿色荧光蛋白基因(EGFP)质粒DNA共孵育,制备阳离子复合物(PEI/DNA)导入HepG2细胞中和/或辐照超声.24 h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪定量分析转染率.结果 超声可促进质粒DNA在HepG2细胞的基因转染.PEI对细胞有毒性,当PEI浓度为0.001%时细胞成活率约为70%,选此浓度用于基因转染实验.2种PEI复合物均能显著促进质粒DNA基因转染,其转染率高于单纯辐照超声介导的基因转染,差异有统计学意义(P＜0.01),2种PEI的转染率工业用组(15.42士4.71)%、实验用组(12.27±3.58)%之间的差异无统计学意义(P＞0.05),加入PEI联合辐照超声后转染率下降(P＜0.01).结论PEI和超声均能促进HepG2细胞基因转染,但PEI联合辐照超声后转染率明显下降,二者没有协同作用.工业用与实验用PEI一样具有促进基因转染的作用.
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超声辐照联合PEI增强体外基因转染的实验研究
目的 探讨超声辐照联合聚乙烯亚胺(PEI)增强子宫内膜癌细胞(Ishikawa)荧光素酶质粒(pCMV-LUC)基因表达的可行性.方法 以不同氮/磷酸盐比(N/P比)将2种不同分子量PEI与质粒DNA共孵育,制备阳离子复合物(PEI/DNA).利用凝胶阻滞实验测定PEI与DNA形成复合物时所需的比例,运用MTT法比较不同浓度PEI的细胞毒性.通过检测荧光素酶活性和细胞活力,评价不同分子量PEI对基因转染的影响及超声辐照的增强作用.结果 当N/P比达到3或更高时,PEI可有效地缩合质粒DNA.细胞毒性与PEI浓度相关.超声辐照均能提高裸质粒和复合物的荧光素酶活性(P<0.05),但前者的增加幅度显著小于后者(P<0.05),25 kDa显著优于750 kDa(P<0.01).适当的转染条件对细胞活力无明显影响.结论 超声辐照联合25 kDaPEI可明显提高基因转染效率,可为基因治疗提供一种高效的新方法.
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超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺增强小鼠腹水瘤基因转染的实验研究
目的 探讨聚乙烯亚胺联合超声造影微泡增强小鼠腹水肿瘤细胞基因转染的可行性和应用价值.方法 建立小鼠腹水瘤模型,分别向小鼠腹腔注入PBS、pEGFP(绿色荧光蛋白质粒)、pEGFP+ SonoVue微泡、PEI(聚乙烯亚胺)+ pEGFP、PEI+ pEGFP+ SonoVue微泡,然后行超声辐照(3 MHz、2 W/cm2、3 min、20％占空比).超声辐照3d后处死动物,荧光显微镜下行EGFP表达观察,流式细胞仪定量分析EGFP的转染效率.结果 A、B组细胞内均无明显可见的荧光显影;C、D组超声辐照可见绿色荧光显影,E组较D组绿色荧光明显,F组绿色荧光强.流式细胞仪显示,与单纯质粒组比较,超声靶向破坏联合聚乙烯亚胺(F组)能明显提高pEGFP转染率.结论 超声靶向破坏联合聚乙烯亚胺可显著增强报告基因在肿瘤组织的转染效率,是一种很有前景、新型而安全的体内基因输送方法.
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超声靶向微泡破裂联合PEI增强小鼠EGFP基因心肌转染
目的 探讨超声靶向微泡破裂(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)增强BALB/c 小心肌绿色荧光蛋白基(EGFP)转染的可行性和应用价值.方法 实验分为7组:PBS组、裸质粒组、质粒+超声辐照组(P+us)、质粒+SonoVue+超声辐照组(P+UTMD)、质粒+PEI组(P+PEI)、质粒+PEI+超声辐照组(P+PEI+US)、质粒+PEI+SonoVue+超声辐照组(P+PEI+UTMD).由BALB/c小鼠尾静脉注入EGFP质粒和SonoVue微泡或PEI的复合物,处理4 d后检测心肌基因表达效率及HE染色,并对超声辐照后的质粒完整性进行分析.结果 电泳显示超声辐照不会损坏DNA或PEI/DNA复合物.非超声辐照时,EGFP只在心内膜下层表达;而超声辐照时,表达强的位置为靠近探头的左室前壁;超声联合PEI时,EGFP的分布差异不明显.P+PEI+UTMD组的转染率高,荧光强度强.结论 UTMD联合PEI可高效、靶向地将质粒DNA输送至心肌,这种非侵入性的技术在心脏基因治疗上很有前景,有望应用于迅速发展的心脏病基因疗法.
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聚乙烯亚胺-肝素结合医用聚氯乙烯材料的肝素释放速率研究
目的 评价聚乙烯亚胺-肝素结合处理的聚氯乙烯(PVC)材料的肝素释放速率.方法 应用聚乙烯亚胺-肝素结合方法,对医用聚氯乙烯材料进行肝素结合处理,同时通过甲苯胺蓝分光光度法评测肝素的释放速率.结果 应用聚乙烯亚胺-肝素结合方法所处理的聚氯乙烯材料表面肝素含量为400～700 μg/cm2,于生理盐水中浸泡700 h后,聚乙烯亚胺-肝素涂层的PVC表面的肝素脱落率为0.89%.结论 聚乙烯亚胺-肝素结合方法涂层的稳定性良好,几乎没有肝素游离脱落,可满足心脏外科体外循环手术的需求.
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PEI/SPIO对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响
目的 探讨应用新型聚乙烯酰胺(PEI)包覆的超顺磁性氧化铁 (SPIO) 标记骨髓间充质干细胞(bMSCs) 对其生物学特性的影响.方法 分离、培养贵州小香猪bMSCs,选取第3代bMSCs,用含铁浓度为4、6、8、10、12 μg/ml的DMEM/F12培养液孵育24 h,未标记组为对照.通过普鲁士蓝染色、透射电镜检查、胎盼蓝染色、MTT检测及成骨、成软骨、成脂诱导分化实验,探讨不同PEI/SPIO浓度对bMSCs标记效率、细胞活性、增殖及分化的影响.结果 铁浓度为8 μg/ml以上的SPIO标记bMSCs后,普鲁士蓝染色标记效率均接近100%.与对照组相比,Fe浓度为4、6、8 μg/ml的PEI/SPIO标记的bMSCs活细胞比率均在95%以上,差异无统计学意义(P>0.05);而Fe浓度为10 μg/ml时,活细胞比率约为(80.24±1.34)%,Fe浓度为12 μg/ml时,活细胞比率约为(75.44±2.33)%,两者对细胞的活性有明显的抑制作用(P<0.05).4、6、8 g/ml的PEI/SPIO标记的bMSCs成骨、成软骨及成脂分化与正常对照组相比无明显差异,而10、12 ug/ml组在诱导培养过程中大部分细胞死亡.结论 含铁浓度8 μg/ml是PEI/SPIO 标记干细胞的适宜浓度,既能高效地标记bMSCs,又不影响bMSCs的细胞活性及增殖分化能力等生物学特性.
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SS-PEI/核酸纳米复合物的构建分析
目的:构建一种可生物降解的基因载体,并观察其体外转染DNA/siRNA的效率和细胞毒性.方法:采用低分子质量PEI与3,3'-二硫代二丙酸在催化剂作用下合成可降解的PEI衍生物SS-PEI,用红外波谱仪和核磁波谱仪分析其化学结构；动态光散射分析动态光散射(dynamic light scattering,DLS) SS-PEI/DNA和SS-PEI/siRNA的粒径；采用流式细胞技术(FCM)和荧光激活细胞分类术(FACS)分别分析SS-PEI对GFP-DNA和FAM-dsRNA的转染率；通过GFP表达水平分析SS-PEI对GFP质粒和GFP-siRNA的转染效率；采用考马斯蓝法分析SS-PEI/DNA和SS-PEI/siRNA的细胞毒性.结果:红外波谱和核磁波谱与SS-PEI理论波谱一致；DLS结果显示,SS-PEI/DNA复合物粒径为95～175 nm,SS-PEI/siRNA平均粒径约200 nm.FCM结果显示,SS-PEI对DNA的大转染率为(25.2±2.3)％,稍低于HWPEI组的(33.8±3.1)％；SS-PEI/GFP-DNA转染后GFP的表达水平与HWPEI转染组接近[(150±7)FI(A.U.)/mg蛋白vs(168±18) FI(A.U.)/ng蛋白],差异无统计学意义,t=1.62,P=0.18；细胞毒性分析显示,SS-PEI/DNA组细胞活力(89±5.2)％,显著高于HWPEI/DNA组的(70±4.9)％,差异有统计学意义,t=4.61,P=0.001.FACS结果显示,SS-PEI对FAM-dsRNA的转染率为(86.5±2.5)％；SS-PEI转染GFP-siRNA,靶基因GFP被显著敲除,相对表达水平为(42±3.5)FI(A.U.)/mg蛋白,与对照组的(79±10.8)FI(A.U.)/mg蛋白相比差异有统计学意义,t=5.64,P=0.004.结论:SS-PEI的合成可明显提高装载核酸的效率,具有低毒和高效等特点.
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Tf-PEG-PEI载细胞特异性干扰质粒靶向沉默前列腺癌核干因子的体外实验研究
目的 探讨非病毒基因转移载体转铁蛋白-聚乙二醇-聚乙烯亚胺(Tf-PEG-PEI)载前列腺特异性膜抗原增强子/启动子(PSMAe/p)为驱动序列的干扰质粒的细胞特异性沉默效果.方法 应用聚乙二醇(PEG)修饰聚乙烯亚胺(PEI),偶联转铁蛋白(Tf)合成靶向载体Tf-PEG-PEI.以Tf-PEG-PEI为载体将细胞特异性干扰质粒pPSMAe/p-shNS-ploy (A)转入前列腺癌LNCap和PC-3细胞中,观察细胞形态变化,检测核干因子(NS)基因和蛋白水平、细胞增殖情况以及细胞周期的变化.结果 成功修饰靶向载体Tf-PEG-PEI,细胞转染后,表达前列腺特异性膜抗原的LNCap细胞中NS表达水平显著降低,细胞膜边缘突起增多,更趋向于分化,细胞增殖速度减慢.在LNCaP细胞中,干扰组S期细胞的百分率[(14.17±0.32)％]明显低于载体组[(19.65±0.64)％]和对照组[(20.61±0.80)％,均P＜0.01)];干扰组G1期细胞的百分率[(74.69±1.01)％]高于载体组[(71.06±0.38)％]和对照组[(70.17±0.32)％,均P＜0.01].而在各组PC-3细胞中,干扰组、载体组和对照组处于S期的百分率分别为(28.86±1.13)％、(29.47±0.47)％和(29.86±0.36)％,差异无统计学意义(P＞0.05);处于G1期的百分率分别为(63.34 ±0.81)％、(62.56±0.62)％和(61.71±1.07)％,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 非病毒载体Tf-PEG-PEI具有高效基因转移的能力,PSMAe/p驱动shRNA靶向干扰NS基因具有细胞特异性,使用细胞特异性启动子是实现前列腺癌靶向基因治疗的有效策略.
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纳米载体介导的人端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞的增殖抑制作用及端粒酶表达的影响
目的 探讨纳米载体介导的人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸(ASODN)在体内外对食管癌EC9706细胞的增殖抑制作用及端粒酶表达的影响.方法 制备线型聚乙烯亚胺(L-PEI)/ASODN纳米级复合物及NGR修饰的L-PEI/ASODN靶向纳米复合物,转染人食管癌细胞系EC9706.采用激光共聚焦显微镜观察细胞对纳米复合物的摄入情况,通过二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测细胞抑制率,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化法分别检测hTERT mRNA和蛋白的表达情况,Annexin V-FITC/PI双标法检测凋亡细胞.通过体内药物分布实验和抑瘤实验观察NGR的靶向肿瘤细胞作用、裸鼠移植瘤的生长情况、组织形态学和超微形态学改变.结果 共聚焦显微镜观察可见,L-PEI可以保护hTERT ASODN有效进入细胞核内;N/P=10、ASODN终浓度40 μg/ml的L-PEI/ASODN复合物转染细胞后24、48、72和96 h,增殖抑制率分别为45.6%、55.8%、67.0%和83.1%;L-PEI/ASODN转染组hTERT mRNA水平明显降低,hTERT条带与内对照条带灰度值的比值为0.27±0.04,与空白对照组、ASODN转染组和L-PEI/SODN转染组相比,差异均有统计学意义(均P＜0.05),hTERT蛋白不表达;转染48 h后,L-PEI/ASODN转染组细胞凋亡明显,早期凋亡率和晚期凋亡率分别为38.0%和52.2%.NGR修饰的L-PEI/ASODN-FAM纳米复合物注射于荷瘤小鼠,其靶向肿瘤作用明显;给药8 d后,NGR/L-PEI/ASODN静脉给药组和皮下给药组的肿瘤体积均明显小于生理盐水组和NGR/L-PEI/SODN组(均P＜0.05);超微结构观察可见典型凋亡小体.结论 NGR修饰、L-PEI介导下的hTERT ASODN可抑制EC9706细胞的增殖,降低其端粒酶的表达,还可有效到达裸鼠人食管癌移植瘤内,抑制肿瘤的生长.
关键词： 聚乙烯亚胺 端粒酶逆转录酶 反义寡核苷酸 NgR 食管癌细胞系EC9706 -
阳离子聚合物介导下白细胞介素1受体拮抗剂基因兔角膜原位转染及其表达
目的 探讨阳离子聚合物即线性聚乙烯亚胺(PEI)介导下兔角膜基质注射PEGFP-IL-1ra质粒进行基因角膜原位转染的有效性和安全性.方法 以人cDNA文库为模板进行聚合酶链反应(PCR),获得人IL-1ra cDNA片段,构建重组质粒PEGFP-hIL-1ra.以阳离子聚合物为介导转染角膜内皮细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪、蛋白免疫印迹技术检测转染后IL-1ra基因和蛋白的表达.实验组30只Wistar大鼠角膜基质注射PEGFP-hIL-1 ra质粒和PEI-in-vivo的混合溶液20μl(含10μg质粒),对照组15只Wistar大鼠角膜基质注射PEI-in-vivo溶液20μl.注射后1、3、6、14、21 d,收集角膜通过HE染色、透射电镜、锥虫蓝-茜素红染色、免疫组织化学观察IL-1ra基因角膜原位转染后的细胞结构和功能的变化.荧光显微镜下追踪IL-1ra-GFP融合蛋白在角膜的表达部位和表达强度.结果 以cDNA文库为模板扩增出hIL-1 ra cDNA片段,构建重组质粒PEGFP-hIL-1ra.经PstI和BamHI酶切及DNA测序证实了插入片段方向和大小正确.PEI-in-vitro介导下PEGFP-hIL-1ra转染角膜内皮细胞12 h后,可见10%～15%细胞中有GFP荧光表达.Western-blotting检测可见相对分子质量为44 000的hIL-1ra-GFP蛋白表达.PEGFP-hIL-1ra质粒和PEI-in-vivo角膜基质注射后1 d,角膜上皮基底细胞可见荧光条带,6 d时全角膜荧光强度达到高峰,14 d开始减弱,21 d角膜上皮层尚存微弱荧光.对照组观察期内始终未见绿色荧光.实验组角膜HE染色未见病理性改变,角膜上皮基底细胞层p63抗体阳性;锥虫蓝-茜素红联合染色未见角膜内皮细胞损伤;透射电镜显示角膜各层细胞的细胞质内可见IL-1ra-GFP颗粒,未见细胞器的损害.结论 阳离子聚合物介导下角膜基质注射PEGFP-hIL-1ra质粒可快速、有效地将IL-1ra基因转入角膜并表达,为临床上使用抗炎细胞因子IL-1ra对角膜免疫炎性反应相关疾病进行基因治疗提供了新的技术平台.
