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pH敏感性两性壳聚糖/聚乙烯亚胺复合纳米粒的制备及其性能研究
目的 制备pH敏感性两性壳聚糖/聚乙烯亚胺(CEC/PEI)复合纳米粒,并检测其性能.方法 壳聚糖和丙烯酸经过迈克尔加成反应得到可直接溶于水的两性壳聚糖CEC,再与PEI一定条件下自组装形成具有pH敏感性的CEC/PEI大分子复合纳米粒.通过红外、核磁对CEC结构进行表征,浊度法考察CEC的pH敏感性及CEC/PEI复合纳米粒的形成.以混合法包载盐酸阿霉素,并对其体外释药行为进行考察.结果 复合纳米粒包载盐酸阿霉素载药量可达10.45％,包封率为15.53％,缓释效果明显.结论 CEC/PEI复合纳米粒有良好的pH敏感性,对盐酸阿霉素具有一定包载能力,体外释放具有明显的缓释作用.
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可降解非病毒基因载体PEG-b-（PG-g-PEI）的合成与表征
目的：结合重组低分子量PEI和PEG结构修饰两种手段合成出新型可生物降解的非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)。方法用相对分子质量600的聚乙烯亚胺氨解嵌段聚合物PEG-b-PBLG，合成非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)；利用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱、激光粒度分析仪、zeta电位仪和凝胶电泳对载体及其与DNA复合物进行了表征，并通过体外细胞实验考察了载体的细胞毒性与转染效率。结果我们成功合成出窄分布的非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)；凝胶电泳测定结果表明当N/P比大于5时载体能很好地包裹DNA；载体与DNA形成的复合物粒径为120 nm，zeta电位25 mV；通过MTT实验和体外质粒转染实验显示出载体在测量范围内具有极低的细胞毒性和很高的转染效率。结论聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)有望作为非病毒基因传递载体。
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PKCα反义核酸对肺癌A549细胞增殖的影响
目的 探讨聚乙烯亚胺(PEI)介导的人蛋白激酶Cα(PKCα)基因反义寡核苷酸(ASODN)对人肺癌A549细胞生长增殖及PKCα基因表达的影响.方法 以PEI介导PKCα ASODN,随机寡核苷酸(RODN)分别转染A549细胞,采用WST法和克隆形成抑制实验分析细胞生长增殖抑制效果;RT-PCR检测PKcd mRNA的表达水平;Western blotting检测PKCα蛋白的表达水平.结果 PEI介导的PKCaASODN转染A549细胞后,细胞牛长增殖和克隆形成均受到抑制(P<0.05),并呈浓度依赖关系,其抑制率明显高于PEI或PEI介导的RODN组;RT-PCR和Westernblotting结果均表明:PEI 介导的PKCαASODN转染A549细胞能明显抑制PKCα的表达,与空白对照组、PEI或PEI介导的RODN转染组相比,有统计学差异(P<0.05).结论 PEI介导的PKCα反义核酸能下调PKCα基因的表达,显著抑制A549细胞生长和增殖.
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胆固醇-聚乙烯亚胺共聚物的制备及其表征
目的 用胆固醇(Chol)对聚乙烯亚胺(PEI)进行改性,制备适用于基因转染的非病毒类载体.方法 用胆固醇甲酰氯(Chol-Cl)连接聚乙烯亚胺的氨基形成PEI-Chol脂质共聚物,分别用IR、1H-NMR、凝胶色谱法、DSC对聚合物进行表征.结果 在IR图谱上可见1800cm-1峰为Chol-Cl的羰基特征峰,形成PEI-Chol后,羰基特征峰迁移至1700cm-1,表明聚乙烯亚胺与胆固醇成功连接；根据1H-NMR谱图计算PEI的胺基接枝率、组成及相对分子质量,达到试验预期效果,表明反应可控；凝胶色谱法测定发现聚合物为单峰,表明连接成功,且聚合物相对分子质量的测定值与1H-NMR估算值比较接近；DSC图谱显示PEI连接胆固醇,Chol-Cl的吸收峰消失,熔融峰?升高变钝,表明PEI-Chol刚性增强.结论 成功合成了PEI-Chol脂质共聚物.
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PEI介导PKC-α反义核酸对肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用
目的:研究聚乙烯亚胺(PEI)-PKC-α反义脱氧核寡酸(ASODN)对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用.方法:RT-PCR检测肝癌SMMC-7721细胞、HepG2细胞PKC-α mRNA表达的差异,细胞增殖抑制实验检测PEI和ASODN混合的佳质量比,WST法和克隆形成抑制实验检测细胞增殖抑制作用,免疫荧光检测PKC-α的表达水平.结果:SSMC-7721细胞PKC-α mRNA表达相对较高,PEI和ASODN的质量比为0.75/1时是PEI转染反义核酸的合适比例,对SMMC-7721细胞具有明显的增殖克隆抑制作用,且呈剂量-效应关系;ASODN和PEI-ASODN对SMMC-7721的IC50分别为16.6 μmol/L和0.58 μmol/L;PEI-ASODN能够有效抑制PKC-α蛋白的生物合成.结论:PEI-ASODN能显著抑制SMMC-7721细胞增殖和克隆形成,下调PKC-α蛋白的表达.
关键词： 蛋白激酶C-α 聚乙烯亚胺 反义核酸 肝癌 SMMC-7721细胞 -
聚乙烯亚胺介导的生存素反义核酸提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性
目的:探讨聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)介导的生存素(survivin)反义核酸(antisense-oligonucleotides,ASODN)联合5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、三氧化二砷(arsenic trioxide)或羟基喜树碱(hydroxycamptothecine,HCPT)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用.方法:单独应用不同浓度的5-FU,As2O3,HCPT,或这些药物分别与survivin ASODN或PEI-ASODN联合应用,作用于SMMC-7721细胞,采用WST-8法检测SMMC-7721细胞的增殖抑制率,并计算药物作用的IC50.以金正均的概率和法进行协同作用分析.结果:不同浓度的5-FU,As2O3或HCPT联合PEI-ASODN(ASODN终浓度为0.125μmol/L)均明显降低这些化疗药物的IC50,提高SMMC-7721细胞对5-FU,As2O3或HCPT的敏感性,增敏倍数分别为36.1、4.16、18.8.金正均Q值法分析表明,5-FU,As2O3或HCPT与PEI-ASODN联合使用,均表现出协同作用.结论:PEI介导的低浓度的生存素反义核酸可提高人肝癌细胞SMMC-7721对5-FU,As2O3和HCPT的敏感性,PEI介导的生存素反义核酸与5-FU联合的作用效果佳.
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聚乙烯亚胺介导生存素反义核酸体外投递肝癌SMMC-7721细胞的条件优化
目的:探讨聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)作为生存素(survivin)反义核酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)的载体投递肝癌SMMC-7721细胞的条件.方法:凝胶阻滞实验筛选PEI与survivin ASODN形成静电复合物的佳质量比;WST-8法检测PEI对肝癌细胞的毒性;流式细胞仪及WST-8法筛选荧光标记的PEI与ASODN在不同质量比时的瞬时转染效率及48 h转染效率;流式细胞仪及荧光显微镜分别检测荧光标记的ASODN以及PEI-ASODN复合物进入细胞的情况;WST-8法检测血清对PEI转染效率的影响.结果:m(PEI):m(ASODN)为0.625:1～2.5:1时可以形成电中性状态的静电复合物;PEI终质量浓度≤4μg/mL对肝癌细胞的毒性较小;m(PEI):m(ASODN)为0.75:1时转染效率高;血清存在对PEI转染效率无明显影响.结论:PEI是一种低毒的ASODN投递载体,其终质量浓度≤4 μg/mL可作为肝癌细胞的转染载体,血清条件下m(PEI):m(ASODN)为0.75:1时,PEI携带survivin ASODN投递肝癌SMMC-7721细胞的效率高.
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聚乙烯亚胺转染人神经母细胞瘤细胞效果的影响因素
目的 探讨聚乙烯亚胺(PEI)转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)效果的影响因素.方法 利用电泳阻滞实验测定PEI与DNA形成复合物时所需的比例,通过MTT法测定PEI对SH-SY5Y细胞的毒性,采用流式细胞术检测细胞转染效率,探索转基因次数对PEI转基因效率的影响.结果 PEI完全结合DNA的N/P比为≥3.PEI转基因时,PEI终浓度应≤7 μg/mL.在N/P=9时,转染细胞阳性比例较高.增加转染次数不能提高转染效率.结论 PEI是有效的体外真核细胞转染剂,可作为SH-SY5Y的基因载体.
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半乳糖受体介导的PCNA反义核酸提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性
目的研究半乳糖(galactose,Gal)-聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)介导的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)反义核酸(antisense oligdeoxynucleotides,ASODN)分别与3种常用化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU),顺铂(cis-Diamminedichloroplatinum,DDP),羟喜树碱(hydroxy icamptothecine,HCPT)联合作用于人肝癌Bel-7402细胞,观察它们对细胞增殖的抑制作用.方法将Gal-PEI与反义核酸形成交联复合物Gal-PEI-ASODN,用CCK-8细胞计数试剂盒检测单纯使用化疗药物以及联合0.03μmol/L ASODN或0.03μmol/LGal-PEI-ASODN对Bel-7402细胞增殖的抑制作用,并分别计算抑制率和IC50.结果单纯使用5-FU,DDP,HCPT作用于Bel-7402细胞48 h,其IC50分别为16.15,1.88,0.31 μg/ml;ASODN与上述药物联合使用其IC50分别为12.59,1.71,0.27 μg/ml,将Bel-7402细胞对化疗药物的敏感性分别提高到单用化疗药物的1.28,1.10,1.15倍;Gal-PEI-ASODN与上述药物联合使用其IC50分别为0.51,0.90,0.10 μg/ml,将Bel-7402细胞对化疗药物的敏感性分别提高到单用化疗药物的31.67,2.09,3.10倍.金正均Q值法分析表明:5-FU与Gal-PEI-ASODN联合使用,表现为协同作用;DDP,HCPT与Gal-PEI-ASODN联合使用,表现为相加作用.结论半乳糖受体介导的低浓度的PCNA反义核酸分别与化疗药物5-FU,DDP,HCPT联合使用,可提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性,通过与化疗药物的相加作用或协同作用,减少化疗药物的用量.
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硬脂酸修饰的聚乙烯亚胺作为siRNA载体的体外评价
目的:考察硬脂酸(SA)修饰的聚乙烯亚胺(PEI)的细胞毒性及转染siRNA的性能.方法:硬脂酸通过羧基与伯氨基脱水缩合嫁接到PEI分子上；激光粒度仪检测粒径及zeta电位；MTT法评价PEI被修饰后的细胞毒性；流式细胞仪、荧光显微镜、荧光酶标仪检测材料转染siRNA的性能.结果:修饰产物PEI-SA结合核酸分子前后粒径分别为(61.2±22.4) nm和(70.9±41.4)nm,zeta电位分别为(25.5±4.5)mV和(18.0±4.5) mV; PEI-SA浓度低于64μg/mL时没有细胞毒性,而修饰前的PEI浓度高于8 μg/mL时就有明显的细胞毒性；PEI-SA对siRNA的转染效率高可达(94.7±1.3)％,高于修饰前PEI组及脂质体组；转染进入细胞的siRNA量随siRNA的浓度升高及转染时间增长而增多.结论:硬脂酸对PEI的修饰,降低了PEI的细胞毒性,增高了转染效率.PEI-SA可以作为一种有效的非病毒基因载体.
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聚乙烯亚胺的修饰及其作为基因载体的研究
目的:考察聚氧乙烯硬脂酸酯(POES)修饰聚乙烯亚胺(PEI)后聚合物的细胞毒性及其与DNA形成复合物后的载体性质.方法:使用琥珀酰亚胺碳酸酯法将POES连接在PEI上,通过1H-NMR确定接枝聚合物的结构,将接枝聚合物与DNA形成复合物后考察其琼脂糖凝胶电泳行为及测定其粒径、Zeta电位;MTT法考察接枝聚合物的细胞毒性,使用质粒pGL3-lus作为报告基因,测定虫荧光素酶活性以评价复合物对Hela细胞的转染效率.结果:1H-NMR结果表明接枝聚合物具有较高的纯度.凝胶电泳表明接枝聚合物对DNA的包裹能力随着N/P值的增加而升高,随着POES接枝数目的增大而降低.复合物的粒径小于300nm,Zeta电位随N/P值的增加而升高.接枝聚合物细胞毒性显著低于PEI,POES接枝数目低的聚合物转染效率较高.结论:POES修饰的PEI可以作为一种有效的非病毒基因载体.
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不同相对分子质量聚乙烯亚胺体外介导基因传递的研究
目的 研究4种不同相对分子质量聚乙烯亚胺(PEI)作为非病毒基因载体体外介导基因传递的能力.方法 采用四甲基噻唑蓝法(MTT法)测定了PEI对Hela细胞的毒性,利用琼脂糖凝胶电泳阻滞试验考察PEI与DNA的结合能力,测定PEI-DNA复合物的粒径和Zeta电位,以及考察转粢率.结果 PEI的细胞毒性与相对分子质量呈正相关,高相对分子质量PEI的细胞毒性远大于低相对分子质量PEI;高相对分子质量PEI在较低的N/P比时就能对DNA起到完全阻滞作用;低相对分子质量PEI与DNA形成的复合物粒径明显大于高相对分子质量的PEI;Zeta电位随着PEI相对分子质量的增大而增大,复合物的粒径和Zeta电位都与组成中的N/P比有关;相对分子质量为2000的PEI(PEI 2K)在Hela细胞中的转染率低,而相对分子质量为25000的PEI(PEI 25K)的转染率高.结论 PEI的相对分子质量对其各项性能指标以及介导基因传递的能力都有较大影响.
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聚乙烯亚胺介导基因转染的影响因素研究
目的 研究非病毒基因载体聚乙烯亚胺(PEI)介导基因转染的影响因紊.方法 采用透射电镜观察PEI与DNA形成复合物的形态,分别考察质粒量、复合物形成时间、复合物在细胞上作用时间和氮磷比(N/P)对转染效率的影响,以筛选较优的转染条件.结果 PEI可有效地与DNA形成复合物,当质粒量为每孔2 μg、复合物形成时间为30 min、复合物在细胞上的作用时间为4 h且N/P为20时转染效率高.结论 PEI可作为合成新型非病毒栽体的骨架,但必须控制有关因素才能得到佳的和可重复的转染结果.
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PEI/ASON纳米组装体对肺腺癌A549细胞增殖活性及其hTERT基因表达的影响
目的 以聚乙烯亚胺多聚阳离子纳米载体( polyethylenimine,PEI)作为端粒酶逆转录酶(human telomerasereverse transcriptase,hTERT)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)载体转染A549细胞,研究其对A549细胞的增殖活性及hTERT mRNA表达的影响.方法 采用MTT法检测PEL/ASODN纳米组装体对细胞的增殖作用情况;激光共聚焦显微镜检测5'-FITC标记的ASODN( FASODN)转染细胞后PEI/FASODN纳米组装体的细胞摄人情况;RT-PCR检测转染后hTERT mRNA的表达;免疫细胞化学技术检测端粒酶hTERT蛋白的表达;流式细胞术Annexin-V-FITC和PI双标法检测细胞凋亡情况;PEI/ASON-PEG-CNGR组装体动物体内分布实验观察NGR的肿瘤靶向作用.结果 PEI/ASODN纳米组装体转染细胞后产生良好的生长抑制作用;FASODN转染细胞后,PEI/FASODN组细胞内有大量荧光物质,而单纯FASODN组细胞内无明显荧光;RT-PCR检测结果表明PEI/ASODN纳米组装体作用于A549细胞72h时,hTERTmRNA水平明显降低,与空白对照组相比有显著差异(P＜0.05);细胞hTERT蛋白的表达也显著降低;转染72h后PEI/ASODN组出现明显早期凋亡和晚期凋亡,凋亡率分别为36.53％和54.28％;动物体内分布实验表明PEI/ASON-PEG-CNGR具有良好的肿瘤靶向作用.结论 PEI介导的hTERT ASODN能有效抑制A549细胞增殖,降低hTERT mRNA水平从而抑制hTERT蛋白的表达,使细胞产生凋亡,对该细胞生长有明显抑制作用.
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聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体制备及体外实验研究
目的 制备聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体并研究其理化性质的表征参数和体外转染效率.方法 通过化学还原法制备聚乙烯亚胺修饰的纳米金基因载体,用绿色荧光蛋白质粒(pAcGFP-N1)做报告基因,纳米基因载体可通过静电吸附的方式结合质粒DNA.用紫外分光光度计检测其吸收光谱,用透射电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布、表面电位(Zeta电位),1％琼脂糖凝胶电泳检测该基因载体与质粒DNA的结合稳定性,CCK-8实验检测聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体及DNA-纳米金复合物对HEK293细胞的细胞毒性作用,通过荧光显微镜观察聚乙烯亚胺纳米基因载体介导pAcGFP-N1在体外培养的HEK293细胞中的表达,并分析其转染效率.结果 聚乙烯亚胺还原氯金酸可以得到带正电荷的纳米颗粒,呈单分散球形分布,其粒径为(12.3 ±3.3)nm.在pH =7.2时,Zeta电位为+(29.7±5.1)mV.1％琼脂糖凝胶电泳结果表明,当纳米金/质粒DNA≥0.5时,质粒DNA可完全结合到纳米金表面.体外转染实验表明,聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体能介导pAcGFP-N1转染HEK293细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白,其转染效率可达25％.结论 聚乙烯亚胺修饰纳米金是一种新型非病毒基因载体,具有转染效率高、对细胞毒性小等优势.
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G250mAb修饰的肿瘤细胞靶向基因载体功能研究
目的：分析G250mAb与聚乙烯亚胺（PEI）偶联作为肿瘤靶向基因载体系统的优越性，为肿瘤细胞靶向基因治疗提供研究基础。方法通过二硫键将G250mAb与PEI偶联，得到修饰后的基因载体G250mAb-PEI，利用体外转染细胞的方法研究其转基因的优越性。结果 G250mAb-PEI转染效率明显高于单纯PEI或传统脂质体转染；其毒性也较未修饰的PEI低；对人宫颈癌细胞Hela的基因转染具有显著的靶向性，其转基因效率是肝癌细胞HepG2（G250阴性）的2倍，而对正常血管平滑肌细胞的基因转染效率较Hela低近20倍。结论 G250mAb-PEI是一种高效、低毒和具有靶向性的基因载体。
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聚乙烯亚胺基因转染载体的研究进展
安全有效的基因载体是实现基因治疗的必要条件,由于聚乙烯亚胺易于合成和改性,可以方便地与DNA形成紧密的超分子复合物,保护DNA免受核酸酶的降解,并促进其进入细胞,从而成为非病毒基因载体研发热点.本文从提高聚乙烯亚胺作为基因载体的转染效率及降低其毒性方面综述了聚乙烯亚胺基因载体的研究进展.
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聚乙烯亚胺介导三质粒共转染HEK293细胞的条件优化
本研究用聚乙烯亚胺(PEI)介导表达绿色荧光蛋白(GFP)的rAAV包装系统(pAAV-CMV-GFP、pAAVRC和pHelper)转染人胚肾293细胞(HEK293细胞).用ImagePro Plus6.0图像分析软件计算表达GFP的细胞比例来测定1、2、3、4、5、6 μg/孔不同质粒剂量,1∶1、3∶1、5∶1、7∶1不同PEI/质粒比值及转染12、24、36、48、60、72 h不同时间三个变量对转染效率的影响,以优化PEI介导三质粒共转染HEK293细胞的条件.结果显示,质粒剂量为4μg/孔、PEI/质粒比值为3∶1～5∶1时转染效率维持较高水平;转染效率-转染时间曲线为S型增长曲线,转染效率于60 h达到平台期.优化PEI转染条件能增加三质粒共转染HEK293细胞的转染效率.
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石墨烯基纳米银复合材料的制备及性能评价
本实验制备采用聚乙烯亚胺修饰的石墨烯基纳米银复合材料(AgNP/rGo-PEI),并对其性能进行评价.其方法是首先制备AgNP/rGo-PEI,然后通过与聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米银(PVP/AgNP)的比较,分析其稳定性、抗菌活性和细胞毒性.研究发现,纳米银(AgNP)在AgNP/rGO-PEI表面的分布相对均匀,其质量分数为4.5％,粒径为6～13 nm.在无光或光照强度为3 000 lx的低温光照仪环境下储存10 d,PVP/AgNP聚集作用较为明显,而AgNP/rGO-PEI则分散性良好,聚集作用不明显.AgNP/rGO-PEI具有更加良好的抗菌活性、生物相容性和相对较低的生物毒性.因此AgNP/rGo-PEI质量可靠,性能良好,具有广阔的应用前景.
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含肝细胞生长因子(HGF)红色荧光融合蛋白基因质粒的构建
为了更真实准确地标示真核细胞内外源肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)的表达,构建含HGF红色荧光融合蛋白(Red fluorescent protein, RFP)基因的质粒.实验中以pMD19-T-HGF为模板,PCR扩增得到去除了终止密码子的HGF基因全长序列,并定向插入pDsRed-express-N1质粒.重组质粒用限制性内切酶酶切和DNA序列测定鉴定后转染293T细胞,观察细胞中HGF mRNA及其蛋白和红色荧光蛋白的表达.结果表明pDsRed-HGF质粒中所插入目的基因大小及其序列与GenBank中HGF cDNA序列完全一致,并可在293T细胞中高水平表达.本实验成功构建了在真核细胞中表达的pDsRed-HGF重组质粒.
