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结核杆菌Ag85A和mGM-CSF共同表达载体的构建与CTL活性的诱导
构建、鉴定结核杆菌Ag85A和细胞因子GM-CSF共同表达质粒,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略.先从质粒pBSby5中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pIRES上成为pI85A,用PCR方法从pc-mGM-CSF质粒中扩增出mGM-CSF,构建于pI85A质粒上,成为共同表达质粒pI85AGM.然后转染7721细胞,进行蛋白的表达和鉴定.结果经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确.通过RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot检测证实Ag85A与mGM-CSF基因的转录和蛋白表达正确.Ag85A与mGM-CSF免疫组小鼠的CTL活性明显增强.表明细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A共同表达载体构建成功,并能诱导小鼠的CTL活性,为研制新型结核病疫苗奠定了基础.
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IL-2的真核表达载体对乙肝病毒基因疫苗的免疫佐剂效应
单以乙肝病毒S区基因疫苗(pCR3.1-S)或联合IL-2真核表达载体(pDOR-IL-2)注射BALB/c小鼠(H-2d)股四头肌,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4 h 51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL活性.免疫8周后,单注射pCR3.1-S及共注射IL-2真核表达载体的小鼠血清450 nm A值分别为1.24±0.1及1.98±0.17.CTL细胞杀伤活性分别为(50.5±6.4)%、(61.9±7.1)%,两组均有明显差异(P＜0.01).脾细胞悬液经抗CD4+单克隆抗体处理后CTL细胞杀伤活性分别为(48.3±5.9)%、(56.2±6.1)%,抗CD8+单克隆抗体处理后分别为(10.6±1.4)%、(13.6±1.3)%.结果表明,IL-2的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答,CTL细胞杀伤活性主要由CD8+执行.基因疫苗可能用于预防及治疗HBV感染.
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病毒性肝炎基因治疗研究的现状
世界大多数国家人群中乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染率较高且极易慢性化,是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因,严重威胁人们健康,而我国是HBV、HCV感染的高发区.
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马来丝虫肌球蛋白29表位基因真核表达质粒及原核表达蛋白免疫小鼠诱导的免疫应答
目的 观察马来丝虫肌球蛋白29(Brugia malayi myosin 29,BmM29)表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmM29和原核表达的纯化重组蛋白rBmM29免疫小鼠诱导的免疫应答效果. 方法 在大肠埃希菌(Escherichia coli BL21诱导表达重组蛋白rBmM29,纯化后作为重组蛋白疫苗;纯化真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-BmM29作为核酸疫苗.核酸疫苗免疫注射部位为小鼠后腿胫前肌,重组蛋白为皮下多点注射.60只BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D、E组,每组12只,分别注射PBS(100 μg)、pcDNA3.1(+)/CpG(100 μg/30 μg)、pcDNA3.1(+)-BmM29/CpG(100μg/30 μg)、rBmM29/CpG(50 μg/30 μg)、pcDNA3.1(+)-BmM29/rBmM29/CpG(前2次注射pcDNA3.1 (+)-BmM29/CpG 100 μg/30 μg,第3次注射rBmM29/CpG 50 μg/30 μg),共免疫3次,每次免疫间隔2周.初次免疫后第4、6、8周,眼球摘除法采血制备血清,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体效价.免疫第8周处死小鼠,制备脾细胞悬液培养48 h,ELISA检测培养上清中细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4 (IL-4)水平. 结果 ELISA检测结果显示,A、B、C、D和E组小鼠初次免疫后第4周血清中抗体的吸光度(A490值)分别为0.038±0.050、0.053±0.009、0.360±0.035、0.456±0.025、0.370±0.025,第6周分别为0.045±0.003、0.045±0.005、0.510±0.018、0.548±0.010、0.552±0.018,第8周分别为0.041±0.004、0.044±0.009、0.606±0.047、0.674±0.042、0.770±0.041,C、D、E组均高于A、B组(P＜0.05),第8周时,E组IgG抗体的A490值高于C组和D组(P＜0.05).初次免疫后第8周,A至E组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的水平分别为(47.72±8.94)、(50.43±2.81)、(304.78±8.42)、(242.28±5.99)、(426.52±6.76) pg/ml,C、D、E组均高于A、B组(P＜0.05),E组高于C组和D组(P＜0.05);小鼠脾细胞培养上清中IL-4的水平分别为(60.00±11.14)、(57.71±15.95)、(93.17±12.56)、(96.67±11.48)、(101.17±5.81) pg/ml,C、D、E组均高于A、B组(P＜0.05). 结论 pcDNA3.1(+)-BmM29核酸疫苗和rBmM29重组蛋白均可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,核酸疫苗与重组蛋白疫苗联合免疫效果更佳.
关键词： 马来丝虫 肌球蛋白29表位基因 重组蛋白 基因疫苗 蛋白疫苗 -
杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒的免疫原性研究
目的 研究杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin的免疫原性.方法 将18只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组9只.两组分别肌肉注射重组质粒pcDNA3.1-amastin和空质粒pcDNA3.1(+) (50 μg/只),2周后同法加强免疫1次.加强免疫后第7、14和21天每组各取小鼠3只,内眦采血,分离血清,间接ELISA法测定血清中抗原特异性抗体水平.随后脱颈处死小鼠,无菌取脾,分离脾细胞,用刀豆球蛋白A刺激培养,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测脾淋巴细胞增殖活性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-4的水平.结果 加强免疫后第7、14和21天,实验组均检测到特异性IgG抗体,效价在1:640以上,而对照组未检测到IgG抗体(P＜0.01);实验组脾淋巴细胞增殖活性刺激指数分别为4.28±0.51、5.01±0.60和4.39±0.50,均高于对照组(P＜0.01);实验组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ含量分别为(42.06±4.26)、(66.02±6.02)和(58.29±3.75) pg/ml,IL-2含量分别为(38.21±5.11)、(64.79±8.67)和(52.69±7.15) pg/ml,均高于对照组(P＜0.01),两组均未检测到IL-4;实验组脾淋巴细胞CTL杀伤活性分别为(42.20±5.96)%、(63.66±5.44)%和(52.24±4.56)%,均高于对照组(P＜0.01).结论 杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin免疫小鼠后可诱导其产生特异的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答.
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细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗体外瞬时表达及对小鼠诱导的免疫应答
目的检测细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗(pcDNA3-Eg95)体外瞬时表达,探讨其诱导小鼠的体液和细胞免疫效果.方法 pcDNA3-Eg95经脂质体转染HeLa细胞瞬时表达.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Eg95抗原信使RNA(mRNA)在HeLa细胞中的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测Eg95蛋白的瞬时表达情况.pcDNA3-Eg95基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA检测IgG和IgG2a水平,四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应.结果 RT-PCR检测结果显示,pcDNA3-Eg95瞬时表达组有Eg95抗原基因mRNA表达,ELISA和Western blotting检测结果表明,可在HeLa细胞中特异性表达Eg95蛋白.用pcDNA3-Eg95基因疫苗免疫BALB/c小鼠,第3周出现特异性IgG免疫应答,持续升高至第10周,显著高于对照组.从第2周开始,小鼠血清IgG2a应答即为阳性,且长时间(至第10周)维持较高水平,与pcDNA3空质粒组比较,其差异具有非常显著性意义(P＜0.01).用原核表达的Eg95重组蛋白刺激免疫小鼠脾细胞,有明显的T细胞增殖反应.pcDNA3-Eg95基因疫苗免疫组刺激指数明显高于pcDNA3空质粒组(P＜0.01).结论pcDNA3-Eg95基因疫苗可诱发小鼠产生特异的体液免疫和细胞免疫应答.
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DNA疫苗诱导小鼠特异性细胞免疫及抗乙型肝炎病毒皮下移植瘤的研究
目的观察乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗(pCR3 1-S)诱导Balb/c小鼠(H-2d)的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达HBsAg的小鼠肥大细胞瘤P815细胞(P815 HBV-S)(H-2d)成瘤性的影响.方法肌肉注射DNA疫苗,背部皮下接种P815-HBV S细胞,观察成瘤情况,4h 51Cr释放法检测小鼠脾细胞细胞毒T细胞(CTL)杀伤活性.结果DNA疫苗可以降低成瘤率,抑制肿瘤生长,延长小鼠平均存活期,提高小鼠存活率.CTL细胞杀伤活性明显增加(P＜0.001).结论DNA疫苗可以诱导细胞免疫应答,对体内HBV感染可能具有预防及治疗作用.
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应用含CpG基序的寡核苷酸增强乙型肝炎病毒基因疫苗诱导的细胞免疫应答
目的 探讨人工合成的含CpG基序的寡核苷酸(ODN)作为佐剂对乙型肝炎病毒(HBV)基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响.方法 构建编码HBV表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗,人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂,以Balb/c小鼠作为实验动物进行免疫接种;采用3H-TdR法、51Cr 4 h释放法等分别检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖和杀伤功能.结果 与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P<0.05);应用CpG ODN组与未应用组相比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P<0.05).结论 CpG ODN作为佐剂可增强HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答.
关键词： 含CpG基序的寡核苷酸 肝炎病毒 乙型 基因疫苗 细胞免疫应答 -
乙型肝炎病毒全S基因疫苗与HBSAg基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答比较
乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国常见病及多发病,HBV难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障得.目前虽然基因重组HBV表而抗原(HBsAg)疫苗预防HBV感染取得了较好的效果,但基因重组HBsAg疫苗主要诱导特异性体液免疫,不能刺激机体的细胞免疫应答.近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2].为了探讨应用HBV基因疫苗预防HBV感染的可能性,我们构建了HBV全S基因和HBsAg基因疫苗,观察和比较子这两种疫苗经肌肉注射接种到Balb/C小鼠体内后的细胞及体液免疫功能的变化,现报道如下.
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ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生的效应脾细胞过继免疫抗肿瘤作用的研究
目的:探讨ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生的效应脾细胞过继免疫在抗肿瘤中的作用.方法:通过转染建立稳定表达ehCGβ和HBV-preS2/S的细胞株Sp2/0-ehCGβ和Sp2/0-preS2/S.以TR421-hCGβ质粒实施基因免疫,免疫后检测小鼠脾细胞,特异性细胞毒活性;同期将脾细胞过继免疫给正常小鼠,以过继TR421-hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞为实验组、过继TR421质粒免疫小鼠脾细胞为对照组,检测脾细胞杀伤效应.结果:效应脾细胞对SP2/0-ehCGβ的杀伤率明显高于Sp2/0-preS2/S(P＜0.05).Sp2/0-ehCGβ在实验组小鼠仅2只形成实体瘤,TR421-hcGβ质粒基因免疫抗肿瘤任用有肿瘤特异性,两组有显著性差异(P＜0.05),而在对照组小鼠均形成实体瘤.Sp2/0-preS2/S在所有的小鼠均形成了实体瘤,其瘤重无显著性差异.结论:ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生的效应细胞可特异性杀伤肿瘤,过继免疫效应细胞能使正常小鼠获得明显的特异性抗肿瘤能力.
关键词： 异位人绒毛膜促性腺激素 效应脾细胞 肿瘤 基因疫苗 过继免疫 -
宫颈癌HPV基因疫苗研究进展
人乳头瘤病毒(HPV)是由核酸和衣壳蛋白组成的DNA病毒,基因组编码10个开放阅读框(ORF),分为早期区(E区),晚期区(L区)和上游调节区(URR),早期区包含E1,E2,E4,E5,E6及E7 6个早期基因,编码合成蛋白,调控病毒转录,复制和转化;晚期区L1和L2编码病毒的主要和次要衣壳蛋白.高危型HPV感染与宫颈癌有关.高危型HPV E6/E7被证实为转化基因,在相关组织中构成性表达,具有很强的抗原性,被首选用来制备HPV基因疫苗;HPV晚期基因L1的产物具有诱导产生中和抗体及细胞免疫的表位,也是制备基因疫苗的理想候选基因.针对E6,E7和L1等基因序列构建的基因疫苗可同时激活体液免疫和细胞免疫,对宫颈癌有预防和治疗作用.
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防龋基因疫苗pcDNA3-PAc兔鼻腔黏膜免疫防龋的实验研究
目的:观察防龋基因疫苗pcDNA3-PAc经鼻腔黏膜免疫日本长耳大白兔后的免疫反应性,确定不同剂量质粒pcDNA3-PAc免疫机体后的抗体效价.方法:30只日本长耳大白兔随机分为5组,每组6只,分别为200、400、600 μgpcDNA3-PAc质粒组;400 μg pcDNA3质粒组(阴性对照组);灭活全菌疫苗组(阳性对照组).质粒组及全菌组以1∶1比例添加弗氏佐剂后进行免疫,共免疫2次.采用间接ELISA法检测血液、唾液中特异性IgG、S-IgA抗体.采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析.结果:①血液、唾液中抗体高峰时间为初始免疫后8～10周左右;②自免疫后第3周开始,200、400、600 μg组兔血清、唾液中特异性抗PAc的IgG、SqgA抗体水平与阴性对照组相比,差异有显著性(P＜0.05);③200 μg组与400 μg及600 μg组相比,多时间点差异有显著性(P＜0.05).结论:①防龋基因疫苗pcDNA3-PAc具有免疫反应性,可诱导免疫反应长达14周;②200、400、600 μg的防龋基因疫苗pcDNA3-PAc对体重1.5 kg左右的兔都是有效的免疫剂量;③在本研究条件下,400、600 μg疫苗组效价优于200 μg组.
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重组质粒pEGFP-N1-Srv+免疫SD大鼠后对龋齿的影响
目的:将已构建的变形链球菌表面蛋白可变区重组质粒pEGFP-N1-Srv+经不同途径免疫SD大鼠,观察其在大鼠体内的原位表达,免疫定菌鼠后的特异性抗体形成及对龋齿的影响.方法:20只SD大鼠随机分为4组,重组质粒pEGFP-N1-Srv+经股四头肌肌肉注射和下颌下腺区皮下注射2种途径免疫大鼠,免疫组化观察重组质粒的原位表达;24只SD大鼠随机分为4组,免疫途径同上,免疫剂量为100μg/只,2周后加强免疫1次.应用间接酶联免疫吸附法检测血清特异性IgG抗体和唾液特异性sIgA抗体,Keyes龋齿计分法评估磨牙的患龋情况.采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计学分析.结果:①大鼠股四头肌细胞、下颌下腺组织内均见重组质粒的阳性表达.②重组质粒pEGFP-N 1-Srv+经不同途径免疫定菌SD大鼠后,可检测到血清特异性IgG抗体和唾液特异性sIgA抗体水平升高,均于首次免疫后第4周达到高峰;该时段各组间的抗体水平,实验组均显著高于对照组(P＜0.01)；经下颌下腺区皮下注射后的sIgA抗体水平显著高于肌肉注射组(P＜0.05).③重组质粒免疫定菌鼠后,实验组和对照组间的龋齿计分无显著差异(P＞0.05).结论:重组质粒pEGFP-N1-Srv+能够在动物体内原位表达,并能诱导SD大鼠血清特异性IgG和唾液特异性sIgA抗体增高；经下颌下腺区皮下注射后的sIgA抗体水平显著高于肌肉注射,具有一定的免疫优势.但该区域单独的龋齿预防效果不明显.
关键词： 变形链球菌 表面蛋白V区 重组质粒pEGFP-N1-Srv+ 基因疫苗 -
变形链球菌重组质粒pcDNA3-pacA/pcDNA3-pacP免疫定菌鼠的实验研究:抗体水平测定分析
目的本研究将已构建的重组质粒pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP经下颌下腺区注射免疫Wistar大鼠,检测抗原物质刺激机体产生的特异性抗体水平的免疫原性.方法重组质粒pcDNA3-pacA、pcDNA3-pacP及pcDNA3-pacA与pcDNA3-pacP联合使用作为基因疫苗经下颌下腺区皮下注射免疫定菌鼠,利用ELISA法测定免疫后大鼠唾液S-IgA、血清IgG抗体水平.结果重组质粒可以诱导机体产生高水平的唾液S-IgA、血清IgG抗体,且明显高于空白组和阴性对照组(P＜O.05).结论重组质粒pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP均可作为有效的免疫原,诱导机体特异性的粘膜免疫应答.
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我国首个治疗类风湿关节炎的基因疫苗获国际金奖
日前，由解放军307医院免疫学研究室奚永志团队领衔的一种治疗类风湿关节炎的DNA疫苗及其用途项目，从48个国家和地区1000多项成果中脱颖而出，荣膺第43届日内瓦国际发明展览会金奖。这是本届发明展上唯一的生物制药领域金奖，也是该项目继2014年第8届国际发明展、2015年第9届北京发明创新大赛后第3次获得金奖。
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血管内皮生长因子及其受体肿瘤疫苗的研究进展
肿瘤疫苗是近年研究的热点之一,其原理是通过激活患者自身免疫系统,利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应,增强机体的抗癌能力,阻止肿瘤的生长、扩散和复发,以达到清除或控制肿瘤的目的.现以血管内皮生成因子为抗原靶标对其相关的肿瘤疫苗研究动向进行综述.
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稳定表达人survivin基因的B16细胞系的建立与鉴定
目的 构建人survivin真核表达载体,稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,建立稳定表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系.方法 采用PCR方法扩增出人survivin全长基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-SUR-(his)_6.利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆.利用RT-PCR、蛋白免疫印迹及免疫荧光等检测方法验证人survivin基因在稳定转染B16细胞株中的表达.结果 经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-SUR-(his)_6重组体构建正确.RT-PCR结果表明:从稳定转染plRES-neo-SUR一(his)_6的B16细胞所抽提的总RNA中能够扩增出survivin基因(约530 bp);蛋白免疫印迹结果表明:利用特异抗体能够从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)_6的B16细胞中检测到survivin蛋白条带,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的条带;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示,稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)_6的B16细胞用特异性抗体检测到高效的荧光表达,其中5号单克隆的荧光表达率为91.38%,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的荧光表达.结论 成功构建了真核表达载体pIRES-neo-SUR-(his)_6,建立了稳定转染高效表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系.
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乙肝病毒adr型基因疫苗诱导小鼠体液免疫应答
目的:构建乙肝病毒adr型基因疫苗pCMVS2-S,观察其免疫小鼠的特异性体液免疫应答.方法:将构建的乙肝病毒基因疫苗注射于C57BL/6小鼠胫骨前肌内,运用ELISA检测不同时间小鼠血清中抗HBs抗体.结果:注射基因疫苗1周后,血清中抗HBs抗体转阳,1个月后抗体达到高峰,并以高水平维持至少2个月.结论:基因疫苗pCMVS2-S能诱导C57BL/6小鼠产生较好的体液免疫应答.
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HBV adr亚型基因疫苗诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答
目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)adr亚型基因疫苗pCMV-S2.S(PS),观察其诱导小鼠所产生的特异性体液和细胞免疫应答.方法:将PS注射于C57BL/6小鼠胫骨前肌内,应用ELISA方法检测不同时间小鼠血清中抗HBs抗体以及采用51Cr释放实验检测淋巴细胞杀伤功能.结果:注射基因疫苗1周后,血清中抗HBs抗体转阳,4周后抗体达到高峰,并以高水平维持至少8周;第12周时PS诱导小鼠产生了良好的HBV特异的细胞免疫应答(P＜0.05).结论:所构建的HBV adr亚型基因疫苗PS能够诱导小鼠产生较好的体液和细胞免疫应答.
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含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗的构建和免疫原性研究
目的研制基于表位的SARS-CoV基因疫苗,为传统灭活或减毒疫苗提供有益的配伍选择.方法通过网络数据库结合生物软件分析的方法,确定可能在SARS-CoV感染过程中起重要作用并具较好抗原性参数的结构区域作为候选抗原表位,以密码子优化的方法提高表位串联蛋白的真核表达效率,构建了含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗.结果多表位串联基因接入真核表达载体后,可在真核细胞内高效表达.多表位嵌合SARS-CoV基因疫苗免疫小鼠后,可诱导融合蛋白特异的体液免疫反应.结论该基于多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗可以诱导抗体应答,为该疫苗的深入研究奠定了基础.
