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实验性黑素瘤文献资料
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稳定表达人survivin基因的B16细胞系的建立与鉴定
目的 构建人survivin真核表达载体,稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,建立稳定表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系.方法 采用PCR方法扩增出人survivin全长基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-SUR-(his)_6.利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆.利用RT-PCR、蛋白免疫印迹及免疫荧光等检测方法验证人survivin基因在稳定转染B16细胞株中的表达.结果 经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-SUR-(his)_6重组体构建正确.RT-PCR结果表明:从稳定转染plRES-neo-SUR一(his)_6的B16细胞所抽提的总RNA中能够扩增出survivin基因(约530 bp);蛋白免疫印迹结果表明:利用特异抗体能够从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)_6的B16细胞中检测到survivin蛋白条带,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的条带;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示,稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)_6的B16细胞用特异性抗体检测到高效的荧光表达,其中5号单克隆的荧光表达率为91.38%,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的荧光表达.结论 成功构建了真核表达载体pIRES-neo-SUR-(his)_6,建立了稳定转染高效表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系.
