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HO-1不同活性真核表达载体的构建及鉴定
目的：构建含有HO-1基因的重组载体并将其稳定转染到肝癌细胞系HepG2中。方法采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1(+)载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞，获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染HepG2细胞系，G418筛选抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞系中HO-1基因的表达。结果成功制作了HO-1活性增高和降低的细胞模型。结论 HO-1不同活性真核表达载体的成功构建，为进一步研究HO-1的功能奠定了基础。
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小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应
目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒,表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白,初步探讨其体外生物学效应.方法 借助RT-PCR技术,从小鼠脾脏总RNA中扩增4-1BB全长编码基因,并导入克隆载体pGEM-T Easy.经测序证实,用PCR扩增其膜外区cDNA,酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3.1中.应用脂质体将重组子pcDNA3.1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞,经G418筛选,获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株.双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达,经蛋白A亲和层析纯化,借助免疫印迹进行鉴定.应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2.4表面4-1BBL结合情况.采用MTT及CFSE(羧基荧光素乙酰乙酸)标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用.结果 经测序证实,所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确;ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用.结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达,可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制,并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础.
关键词： 小鼠4-1BB-Fc 真核表达 稳定转染 混合淋巴细胞反应 -
建立以EGFP为报告基因检测HSV感染的细胞株
单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1, HSV-1)是人类病毒性疾病的常见病原体.建立简单实用的检测HSV-1感染的方法,对HSV-1感染疾病的诊断和治疗非常重要,也可作为抗病毒药物的开发筛药模型的指标.为此,我们建立以加强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)为报告基因检测HSV感染的稳定转染细胞株,为今后的研究提供较为直观的手段.
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质粒转染对细胞生物学特性的影响
目的 通过对乳腺癌细胞系T47D稳定转染,探讨真核表达载体质粒对细胞生物学特性的影响.方法 建立稳定转染细胞系,观察细胞形态学改变,检测细胞增殖能力、软琼脂内克隆形成率和细胞迁移能力.结果 一株转染细胞系(pcDNA-4)与对照组细胞比较,在形态上发生了明显改变,细胞在软琼脂内的克隆集落形成率显著增高,细胞体外迁移能力显著增强.结论 质粒载体DNA稳定转染,可能通过与宿主染色体随机整合,引起多种细胞生物学特性改变.
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人宫颈癌基因RNA干扰真核表达载体的构建及其稳定转染胰腺癌细胞株的建立
目的:构建针对人宫颈癌基因2(HCCR2)有效靶点的RNA干扰真核表达载体,鉴定获得干扰质粒稳定转染的人胰腺癌PANC1细胞株.方法:设计并合成多个针对HCCR2基因的RNA干扰序列,并将其插入真核表达慢病毒载体pGCsi-H1/Hygro/NEGative,通过测序和与HCCR过表达载体共转染293T细胞后行Western blot检测,筛选出有效干扰质粒;通过脂质体转染法将该有效干扰质粒pGCsi-HCCR2稳定转染至人胰腺癌细胞株PANC1.抗生素G418筛选获得稳转细胞株;Westernblo凇测稳转细胞株中HCCR2蛋白表达水平.结果:HCCR2干扰载体和过表达栽体共转染293T细胞后Western blot检测结果表明干扰质粒3具有佳干扰效果,选其作为终干扰质粒.将该质粒稳定转染至胰腺癌PANC1细胞后,Western blot检测显示,干扰组的PANC1细胞株与空载体组比较,HCCR2蛋白表达水平下调,表明获得HCCR2的RNA干扰质粒稳定转染的PANC1细胞株.结论:成功构建了HCCR2的RNA干扰真核表达载体及其稳定转染的人胰腺癌PANC1细胞株.
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Fas相关死亡结构域蛋白荧光真核表达载体的构建及其鉴定
目的: 构建真核表达载体pEGFP-N1-FADD并检测其在结肠癌细胞株SW480中的表达.方法: 设计人FADD特异性引物, 从人结肠癌细胞SW480细胞提取总RNA, 通过RT-PCR方法获取人FADD全长cDNA, 定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1. 应用PCR、酶切和DNA测序进行鉴定, 确认后转染人结肠癌细胞SW480.G418抗性筛选获得FADD稳定表达细胞克隆,应用Western blot检测FADD的表达水平.结果: 测序及酶切鉴定证明获得人全长FADD基因, FADD基因正确插入pEGFP-N1中, 在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在SW480细胞中的稳定表达, Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-FADD的细胞FADD表达水平增高, 是未转染细胞的2.34倍.结论: 成功构建真核表达载体pEGF P-N1-FADD, 并且在SW480细胞中稳定表达.
关键词： Fas相关死亡结构域蛋白 真核表达 绿色荧光蛋白 稳定转染 -
PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在结肠癌SW480细胞中的表达
目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染大肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR检测PRL-3基因表达.结果:获得522 bp的PRL-3基因编码序列并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3和建立PRL-3稳定表达SW480细胞,为进一步深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定基础.
关键词： 蛋白酪氨酸磷酸酶-3 真核表达 绿色荧光蛋白 稳定转染 -
DMBT1过表达对食管癌细胞系EC9706生物学行为的影响
目的: 建立稳定表达候选抑癌基因DMBT1的食管癌细胞系EC9706,并分析转染前后其增殖特点、转移侵袭能力的变化.方法: 脂质体介导法将DMBT1的全长表达质粒转染食管癌细胞系EC9706,G418筛选阳性克隆细胞,Western blot及RT-PCR检测DMBT1蛋白及mRNA水平变化,MTT法绘制细胞生存曲线及无血清条件下测细胞生存抑制率,Transwell实验检测细胞趋化迁移能力变化.结果: 通过稳定转染后,DMBT1蛋白水平及mRNA水平均比对照组提高3.2倍以上,与对照组比较,差异有显著意义( P<0.01);实验组细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比对照组细胞更为缓慢,在无血清培基中增殖抑制率随时间延长不断增高,实验组迁移细胞数为206±25,对照组为367±42,2组比较差异有显著意义( P<0.01).结论: 在体外成功建立稳定表达DMBT1的细胞系,DMBT1过表达在体外显著抑制食管癌细胞系EC9706的生长增殖及趋化迁移.
关键词： 脑恶性肿瘤缺失基因1 稳定转染 食管癌 -
靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响
目的:探讨转入靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响.方法:设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体PSilencer2.1,构建siRNA真核表达载体,经稳定转染HepG2细胞后对转基因后肿瘤细胞的生物学行为进行观察.结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功.通过RTPCR及流式细胞术检测,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达73%和75%.转染细胞生长速度明显减慢,凋亡率增加15倍.裸鼠体内成瘤率下降75%,9-30 d肿瘤体积分别为0.10±0.01 cm3,0.30±0.03 cm3,0.39±0.11 cm3,0.45±0.13 cm3,0.49±0.07 cm3,0.58±0.01 cm3,0.60±0.10 cm3,0.65±0.07 cm3,与对照组相比差异显著(P＜0.01).结论:靶向survivin的siRNA能有效降低目的基因的表达并能在体内体外抑制肝癌细胞株HepG2的生长.为进一步逆转肿瘤细胞的耐药性提供了理论指导.
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胃癌下调新基因CA11的功能研究
目的:胃癌下调新基因CA11的细胞定位及其生物学功能的研究.方法:地高辛标记CA11原位正常胃黏膜组织mRNA杂交.将CA11构建至pcDNA3.1/Myc-His(-)A载体,将其及空载pcDNA3.1/Myc-His(-)A载体稳定转染胃癌7901细胞系,Western blot证实CA11转染细胞CA11融合蛋白表达,行生长曲线及MTT检测,形态学分析结果.结果:NBT/BCIP显色表明,CA11位于正常胃黏膜上皮细胞胞内,CA11稳定转染胃癌7901细胞系表达CA11融合蛋白,生长曲线及MTT检测均表明,CA11显著抑制胃癌7901细胞的生长(72 h,0.379±0.019 A vs 0.467±0.021 A,P＜0.01).较对照组空载转染7901细胞,CA11稳定转染胃癌7901细胞系形态不规则,核糖体、胞膜纤毛明显减少.结论:CA11位于正常胃黏膜细胞,能显著抑制胃癌细胞的生长,可能为一功能强大的候选抑癌基因.
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CXCL-1基因稳定转染肝癌细胞株的建立、鉴定及其细胞生物学特性
目的 建立慢病毒载体介导稳定转染趋化因子CXCL-1的MHCC97-L肝癌细胞株,鉴定转染细胞中目的基因的表达并观察转染CXCL-1对MHCC97-L细胞增殖、迁移、侵袭能力及细胞周期的影响.方法 慢病毒载体介导CXCL-1基因稳定转染MHCC97-L肝癌细胞,qRT-PCR、蛋白印迹方法分别检测转染后细胞中CXCL-1在mRNA和蛋白水平的表达;MTT试验、克隆形成试验,Transwell小板细胞穿膜试验分别检测转染后细胞增殖能力、迁移能力及侵袭能力的变化.结果 成功建立了稳定转染CXCL-1的MHCC97-L肝癌细胞株.转染后细胞高表达CXCL-1基因.转染后MHCC97-L细胞增殖能力显著增强(P＜0.05),侵袭能力显著增强(P＜0.05),迁移能力变化则无统计学差异(P＞0.05).转染后细胞株中G1期细胞比例显著减少(P＜0.05).结论 成功构建稳定转染CXCL-1的肝癌细胞株,CXCL-1可增强肝癌细胞的体外增殖和侵袭能力.
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FasL在肝门部胆管癌免疫逃逸机制中作用的研究
FasL能触发表达细胞表面受体(Apo-1/CD95)的致敏淋巴细胞的凋亡[1].FasL介导的凋亡在耐受识别、T细胞活化诱导的细胞死亡及免疫反应终止等免疫系统的调节方面发挥重要的作用.而在眼和睾丸固有细胞中FasL的表达通过诱导浸润的前炎性免疫细胞的凋亡而介导了它们的免疫赦免.已证实在组织移植实验中FasL也可介导免疫赦免.在啮齿类动物实验中,表达FasL组织的同种移植及非免疫特赦细胞(胰岛细胞)联合表达FasL细胞共同进行的同种移植均获得成功的存活.稳定转染FasL基因的鼠肿瘤细胞的同种移植显示,FasL能导致局部的同种移植特异性的体液及细胞免疫反应的抑制.
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甲状旁腺相关肽小分子干扰RNA诱导HTB-94软骨肉瘤细胞凋亡
甲状旁腺相关肽(PTHrP)近年来被证实在人体软骨肉瘤细胞中表达[1-3].2006年1月至2007年8月我们将PTHrP小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒稳定转染人体软骨肉瘤细胞HTB-94后,观察其对HTB-94细胞中PTHrP蛋白、mRNA、细胞生长曲线以及肿瘤细胞的影响.材料与方法
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分化抑制因子基因沉默的人尤文肉瘤细胞系的建立
目的 应用短发夹RNA(shRNA)技术,构建分化抑制因子(Id2)基因稳定干扰的人尤文肉瘤细胞系,为进一步研究Id2在尤文肉瘤细胞生长、分化中的作用提供有用模型.方法 体外合成3条Id2序列特异性shRNA,构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Id2真核表达载体,通过脂质体转染尤文肉瘤RD-ES细胞,采用Western blot方法检测Id2蛋白表达水平,采用细胞计数法检测shRNA转染后对细胞生长的影响,采用流式细胞术检测转染前后细胞周期的变化.结果 Western blot结果显示,稳定转染shRNA-Id2-543及shRNA-Id2-593的RD-ES细胞中Id2表达水平降低,与对照组相比分别下降54％及57％;转染组细胞的生长速度明显减慢,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞周期S期细胞比例分别为(36.60±1.53)％及(44.89±2.46)％,高于对照组的(29.73±2.03)％,差异有统计学意义(P＜0.05),G2期比例无明显变化甚至降低.结论 成功建立Id2基因沉默的人尤文肉瘤RD-ES稳定转染细胞系.Id2表达下调可抑制尤文肉瘤细胞增殖,细胞周期阻滞于S期.Id2可能在尤文肉瘤细胞生长增殖中扮演重要角色.
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干细胞因子及受体c-kit对A375细胞增殖和凋亡影响的体外研究
目的 利用基因工程方法建立稳定表达干细胞因子受体(SCF/c-kit)的恶性黑素瘤A375细胞株,再给予外源性SCF/c-kit,观察其对A375细胞增殖、凋亡的影响.方法 通过脂质体转染技术构建稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株(hc-kit/A375),给予A375细胞和hc-kit/A375细胞外源性SCF,将所有的细胞分为A375组、A375-SCF组、hc-kit/A375组和hc-kit/A375-SCF组.应用MTT法及流式细胞仪分析细胞的增殖和凋亡,并应用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化方法检测肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF),基质金属蛋白酶(MMP)-9及肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达.结果 ①通过脂质体介导能将c-kit-pcDNA3.1neo重组质粒成功转染入黑素瘤细胞,建立稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株hckit/A375,hc-kit/A375细胞中c-kit表达明显增加.②给予外源性SCF后,细胞的生长受到抑制,以培养后第5天尤为显著；细胞的凋亡率明显增加,S期比例降低,且hc-kit/A375-SCF组尤明显.③转染后细胞及加入SCF干预组VEGF、MMP-9分泌减少,而TNF-α的分泌增加.结论 通过脂质体转染和G418筛选成功构建稳定表达c-kit的A375细胞株；通过增加A375细胞中SCF/c-kit的表达能改变肿瘤细胞对VEGF、MMP-9、TNF-α的分泌,抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡.
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Ku80表达抑制细胞模型的建立及其功能检测
目的 建立利用RNAi技术抑制Ku80表达的HeLa细胞模型,探讨Ku80在放射生物学方面的功能.方法 构建靶向抑制Ku80的siRNA表达质粒,转染HeLa细胞,筛选稳定表达的转化克隆;Western blotting检测Ku80表达变化;6 MV X线照射6 Gy后,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期;克隆形成实验检测细胞SF2、D0等值.结果 构建的质粒转染HeLa细胞获得3个稳定转染克隆,Western blotting分析表明2个阳性克隆Ku80蛋白抑制率分别达到89.3%和96.4%;Ku80表达抑制细胞受X线照射后48及72 h的凋亡率高于对照细胞(P＜0.05),但4株细胞的细胞周期变化无统计学意义(P＞0.05);2个阳性克隆细胞株的D0和SF2值明显降低,在D10剂量时的增敏比分别为1.315和1.365.结论 运用RNAi技术建立的Ku80表达抑制克隆细胞可以成为简单实用的细胞模型;Ku80-siRNA可以抑制Ku80的表达,从而促进HeLa细胞对X线的敏感性.
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端粒酶阴性肿瘤细胞株U2OS中Ku80表达抑制模型的建立及其对放射敏感性的影响
目的 探讨Ku80在端粒酶阴性肿瘤细胞中与端粒和放射敏感性的关系.方法 构建重组表达质粒pshRNA-Ku80,转染U2OS细胞,并筛选稳定表达的转化克隆.RT-PCR和Westernblot分别在基因和蛋白水平检测干扰前后Ku80表达量的变化.定时PCR检测干扰前后端粒长度的变化.克隆形成实验分析pshRNA-Ku80干扰对U2OS细胞放射敏感性的影响.结果 流式细胞仪检测重组质粒稳定转染细胞株的转染效率为(83.23±7.63)％.PCR结果显示,重组质粒组Ku80基因抑制率为(68.09±1.16)％.Western blot结果表明,重组质粒组Ku80蛋白抑制率达到(11.03±2.45)％.端粒长度检测结果显示,重组质粒组的端粒长度(1.07±0.07)明显短于空白组(4.42±1.30) (F =38.58,P＜0.05),而空质粒组端粒长度(4.11±0.84)与空白组无明显变化.克隆形成实验结果显示,重组质粒组细胞株SF2值较空白组降低显著(F=1089.61,P＜0.05),放射增敏比(SER)为1.47.结论 运用RNAi技术所建立的Ku80表达抑制的细胞模型,可用于以后的基因功能研究；在U2OS中,特异性地沉默Ku80会引起端粒长度的缩短,并增加U2OS细胞的放射敏感性,推测pshRNA-Ku80引起端粒缩短很可能是其放射增敏的机制之一.
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黏着斑激酶低表达黑色素细胞株的构建及其初步性质研究
黑色素瘤是一种常见的恶性肿瘤,随着恶性程度的增高,黏着斑激酶(FAK)水平递增.本文利用RNAi技术,成功建立了稳定干扰FAK基因的F10-siFAK及阴性对照F10-control两种细胞系.与对照F10-control相比,F10-siFAK细胞系mRNA表达下降,蛋白表达减少,ERK磷酸化显著降低,细胞周期在G1期阻滞增加,而且在动物体内的生长速度明显降低.稳定干扰FAK基因的黑色素瘤细胞株的建立,为研究FAK在黑色素瘤进程中的作用提供了工具,并为以FAK为靶点的黑色素瘤治疗药物的筛选提供了平台.
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建立NHEJ修复定量体系并检测拓扑异构酶抑制剂依托泊苷对NHEJ的影响
目的 建立含pI-SCE Ⅰ酶切位点的总的非同源末端连接(total non-homologous end joining,Total-NHEJ)和非经典末端连接(altemative end joining,A-EJ)修复底物的细胞株,设置特定的流式细胞术参数,定量检测依托泊苷(etoposide,VP-16)对非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复的影响.方法 本实验通过脂质体转染含修复底物的质粒,嘌呤霉素筛选,构建起NHEJ修复系统的稳定细胞株;运用流式细胞术和PCR技术对所构建的细胞株的基因组DNA进行分析与鉴定;运用细胞免疫荧光及基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测VP-16诱导的DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)损伤,运用流式细胞术定量检测VP-16对NHEJ修复的影响.结果 在所筛选的细胞中的各得到2株阳性细胞株Total-NHEJ和2株阳性细胞株A-EJ.VP-16作用浓度和时间的增加,Total-NHEJ和A-EJ修复效率增加.结论 VP-16诱导DNA损伤的同时,促进总NHEJ修复和A-EJ修复,修复呈现剂量和时间依赖性,但随着浓度和作用时间的增加,VP-16致DSB的损伤能力超过修复能力.
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IDO基因稳定转染HepG2细胞系的建立
目的 建立稳定转染IDO基因的HepG2细胞系,为进一步研究IDO基因在肝癌免疫逃逸中的作用奠定基础.方法 应用脂质体将真核细胞表达质粒pcDNA3.1-IDO和空载质粒pcDNA3.1转染入HepG2细胞,经G418进行筛选后,挑取单克隆进行培养,用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法验证获得的表达细胞株.结果 经RT-PCR和Western blotting检测证实空质粒转染组和空白对照组HepG2细胞无IDO基因及蛋白的表达,而重组质粒组的HepG2细胞表达IDO基因和蛋白.结论 pcDNA3.1-IDO质粒体外稳定转染人肝癌细胞HepG2,可以有效地使IDO基因在RNA水平和蛋白水平均表达,成功建立了稳定转染基因IDO的HepG2细胞系,为进一步探讨该基因的功能奠定了一定基础.
关键词： 吲哚胺2 3-双加氧酶(IDO) HepG2细胞 稳定转染
