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修复DNA双键断裂损伤的NHEJ分子机制研究进展
DNA损伤有碱基损伤和单链断裂、双链断裂(Double strand breaks,DSBs)等多种形式,其中以DSBs损伤为严重.电离辐射(ionizing radiation,IR)、抗癌药物等都能诱发DNA发生DSBs[1].损伤的DSBs若不能被及时修复,会引起染色体断裂、缺失、重排或倒置等现象.因此,DSBs的有效修复对维持基因组的稳定性、保证细胞存活以及抑制肿瘤的发生发展均具有重要作用.在哺乳动物细胞中,DSBs损伤修复有2种主要的形式:同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ) [2].
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DNA双链断裂修复与重症联合免疫缺陷
DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)是细胞DNA损伤的主要类型,它的修复通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两种机制实现.NHEJ是人和哺乳动物细胞DSBs修复的重要通路,主要由DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、X射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)、DNA连接酶Ⅳ、Artemis、XLF/Cernunnos和其它DNA损伤修复辅助因子组成.本文重点介绍了NHEJ机制主要成分的特性及其功能,以及这些组分的基因发生突变或缺失所引起的DSBs修复缺陷与辐射敏感性重症联合免疫缺陷(radiosensitive severe combined immunodeficiencies, RS-SCIDs).
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DNA双链断裂损伤修复系统研究进展
多种内源或外源因素都能造成细胞基因组DNA损伤,细胞内建立了复杂的修复系统来应对不同形式的损伤.其中DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)作为严重的损伤形式,主要激活同源重组修复(Homologous recombination repair)和非同源末端连接(Non-homologous end joining)通路.这两条通路都是由多个修复元件参与、经过多步反应的复杂过程.两者各具特点、协同作用,共同维护细胞基因组的稳定性.对其分子机制的阐明为肿瘤放化疗的辅助治疗提供了潜在的作用靶点.
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X射线诱导γH2AX焦点形成的定量分析及其致DNA双链断裂的动态变化
目的 比较DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs+/+)和DNA-PKcs-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)X射线诱导γ H2AX焦点形成的定量分析,并对鼻咽癌SUNE-1细胞进行X射线致DNA DSB动态变化.方法 采用蛋白印迹检测DNA-PKcs蛋白表达情况,细胞免疫荧光检测X射线5 Gy诱导的γ H2AX焦点形成,通过ImageJ软件分析γ H2AX焦点形成数量的差异.结果 DNA-PKcs在DNA-PKcs-/-和DNA-PKcs+/+MEF细胞中分别表达缺失和正常.应用γ H2AX焦点/细胞和γ H2AX焦点/mm2分析方法动态分析X射线诱导的DNA-PKcs+/+、DNA-PKcs-/-MEF细胞和SUNE-1细胞DSB形成的总体趋势一致;照后0.5~1.0 h大量γ H2AX焦点形成,DNA-PKcs+/+MEF细胞于照后6.0 h完成修复,DNA-PKcs-/-MEF和SUNE-1细胞X射线后于照后24.0 h完成修复.γ H2AX焦点/细胞的峰值出现在照后1.0 h,γ H2AX焦点/mm2的峰值则出现在照后0.5 h.对于DNA-PKcs+/+和DNA-PKcs-/-MEF细胞,γ H2AX焦点/细胞在照后0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h的不同,而γ H2AX焦点/mm2在照后3.0、6.0、12.0 h不同.结论 利用细胞免疫荧光动态检测照后致γ H2AX焦点/细胞或γ H2AX焦点/mm2的分析方法为动态定量研究DSB损伤及修复提供了新的思路.
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基因治疗技术发展在耳聋治疗研究方面的应用
基因治疗是指将外界正常或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，从而改善疾病的一种治疗手段。基因治疗的概念早是在1972年由Friedmann和Roblin提出[1]。既往以同源重组(Homologous Recombination，HR)修复机制为基础的基因打靶(gene targeting)技术在研究基因功能方面发挥重要作用并用于基因治疗的探索。近几年基于同源重组修复机制和不依赖于同源重组的非同源末端连接(Non Homologous End Joining，NHEJ)机制的基因组编辑(genome editing)技术开创了基因研究及治疗的新天地。
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拷贝数变异及其在眼病分子遗传学研究中的应用
拷贝数变异(CNV)是人类基因组内大于1kb的DNA片段拷贝数的异常变化,它广泛存在于正常个体,可能是人类表型变异的重要原因之一,是研究包括眼病在内的人类疾病的热点.目前认为CNV的形成机制可能是非等位基因同源性重组和非同源末端连接等所致.本文对CNV的多态性与表型变异、形成机制、检测方法及其在青光眼、白内障、虹膜发育不良、葡萄膜黑色素瘤、X-连锁眼白化病等眼病分子遗传学中的应用进行综述.
关键词： 拷贝数变异 表型变异 非等位基因同源性重组 非同源末端连接 眼病遗传学 -
V(D)J重组与DNA非同源末端连接
在淋巴细胞发育过程中,编码免疫球蛋白和T细胞受体抗原结合域的基因是由彼此分离的基因片段通过V(D)J重组组装而成的.在V(D)J重组过程中会产生DNA双链断裂,并通过非同源末端连接途径完成断链末端的连接.本文概述了V(D)J重组过程中的非同源末端连接途径,并就其不同于外源性物理、化学因素诱导产生的DNA双链断裂非同源末端连接修复途径加以综述.
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神经上皮细胞转化基因1对细胞辐射敏感性的影响及其机制探讨
目的 探讨神经上皮细胞转化基因1(Net1)对细胞辐射敏感性的影响及相关的分子作用机制.方法 运用实时荧光定量PCR检测辐射后细胞中Net1基因表达水平的变化;采用RNAi干扰技术抑制细胞中Net1的表达,用克隆形成率分析细胞的辐射敏感性;利用免疫共沉淀技术发现Net1的结合蛋白.结果 电离辐射损伤后,细胞中的Net1 mRNA水平显著上升(t=-10.52,P＜0.05);与对照组相比,siRNA沉默细胞中的Net1表达后明显增加了细胞的辐射敏感性(t=15.31、11.65,P＜0.05);无论在正常状态下还是在细胞受到辐照后,Net1都能与非同源末端连接修复蛋白Ku70、Ku80和DNA-PKcs结合.结论 Net1对细胞的辐射防护作用可能是通过与非同源末端连接修复蛋白相互作用来调控辐射损伤修复实现的.
关键词： 神经上皮细胞转化基因1 辐射敏感性 DNA双链断裂 非同源末端连接 -
建立NHEJ修复定量体系并检测拓扑异构酶抑制剂依托泊苷对NHEJ的影响
目的 建立含pI-SCE Ⅰ酶切位点的总的非同源末端连接(total non-homologous end joining,Total-NHEJ)和非经典末端连接(altemative end joining,A-EJ)修复底物的细胞株,设置特定的流式细胞术参数,定量检测依托泊苷(etoposide,VP-16)对非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复的影响.方法 本实验通过脂质体转染含修复底物的质粒,嘌呤霉素筛选,构建起NHEJ修复系统的稳定细胞株;运用流式细胞术和PCR技术对所构建的细胞株的基因组DNA进行分析与鉴定;运用细胞免疫荧光及基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测VP-16诱导的DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)损伤,运用流式细胞术定量检测VP-16对NHEJ修复的影响.结果 在所筛选的细胞中的各得到2株阳性细胞株Total-NHEJ和2株阳性细胞株A-EJ.VP-16作用浓度和时间的增加,Total-NHEJ和A-EJ修复效率增加.结论 VP-16诱导DNA损伤的同时,促进总NHEJ修复和A-EJ修复,修复呈现剂量和时间依赖性,但随着浓度和作用时间的增加,VP-16致DSB的损伤能力超过修复能力.
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DNA双链断裂与同源重组修复的研究进展
DNA双链断裂（DSB）是细胞受到电离辐射后严重的DNA损伤，导致细胞凋亡、细胞周期阻滞以及DNA损伤修复。DNA损伤发生后，激活细胞内DNA损伤应答，启动DSB修复通路同源重组（HR）和非同源重组末端连接（NHEJ）。HR修复分为联会前期、联会期和联会后期，以姐妹染色单体为模板，进行无错误修复，是保护基因组完整性的主要机制。对IR导致的DSB HR和NHEJ具有互补关系，G2和S期HR是主要修复方式。HR是肿瘤发病风险、预后指标和治疗靶点，合成致死是HR用于肿瘤靶向治疗的重要机制。本文主要对DSB修复过程中所涉及HR修复通路中的分子机制、合成致死概念及其与NHEJ修复的关系作一综述，并探讨其成为转化医学研究和潜在临床应用的可能性。
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早期快速反应基因5和Ku70与宫颈癌放疗敏感性及临床意义的相关性研究
目的：探究早期快速反应基因5（ IER5）和Ku70在宫颈癌放疗中的表达，及其与放疗敏感性以及临床病理特征间的联系。方法采集35例Ⅱb～Ⅲb期宫颈癌患者放疗前和放疗中累积放射剂量为2～6 Gy、10 Gy、20 Gy、30 Gy时的宫颈癌组织，应用蛋白质印迹法及实时荧光定量PCR技术检测IER5、Ku70的蛋白和mRNA的表达。分析IER5与临床病理特征间的关系。结果放射剂量为10 Gy、20 Gy、30 Gy 时 IER5的表达（0?818±0?678、0?981±0?734、1?637±0?817）显著高于放疗前（0?503±0?188），差异有统计学意义（t值分别为2?626、3?516、6?919，P均＜0?01），IER5的表达与放射剂量间成正相关（r＝0?498，P＜0?01），随剂量的增大而增大。当放射量为30 Gy时，Ku70的表达（0?494±0?304）高于放疗前（0?318±0?098），差异有统计学意义（t＝2?239，P＜0?05）。放疗前后，IER5与Ku70的表达呈正相关（ r＝0?558，P＜0?05；r＝0?344，P＜0?01）。不同放射剂量下IER5的表达与肿瘤大小间存在交互作用（ F＝2?582，P＜0?05）。结论 IER5可能通过与Ku70相互作用参与调控DNA损伤修复过程，从而影响宫颈癌放疗敏感性，IER5与Ku70有望成为宫颈癌放疗增敏治疗的新靶点。
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髓系白血病细胞DNA非同源末端连接能力的检测
DNA双链断裂(double-strand break,DSB)是致命的DNA损伤,在人类DSB主要的修复方式是非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)[1].大部分DNA损伤都能修复,不能修复或不恰当的修复会造成基因变异、肿瘤发生和细胞死亡.
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DNA双链断裂修复途径中重要的修复蛋白
DNA双链断裂修复是DNA损伤主要的修复途径之一,修复基因可以修复DNA损伤,保持遗传信息的完整性,从而抑制肿瘤的发生.目前已知参与DNA双链断裂损伤修复的机制有两种——非同源性末端连接和同源重组修复机制.该文介绍了参与非同源末端连接和同源重组修复机制的几种重要的修复蛋白.
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DNA非同源末端连接与肿瘤的发生及治疗
DNA双链断裂是真核生物严重也是致命的DNA损伤类型,如果无法及时修复就可能启动细胞的凋亡,若是错误修复将导致基因突变或基因组不稳定性,终会导致肿瘤的产生.非同源末端连接途径作为哺乳动物修复双链断裂的主要机制,它的功能不仅对维持基因组的完整性和细胞的稳定性有重要作用,而且和肿瘤治疗疗效有着密切相关性,修复活性的抑制可以很大程度地提高治疗的敏感性.该文综述了非同源末端连接途径在肿瘤的发生及治疗上的重要作用和机制.
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非同源末端连接机制与基因扩增关联的研究进展
基因扩增是肿瘤中基因组异常形式之一,与肿瘤发生发展及耐药性有密切关系.非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)是哺乳动物DNA双链断裂(doublestrand breaks,DSBs)修复的主要机制之一,在维持基因组的稳定性中发挥着重要作用.近年来,非同源末端连接与基因扩增关系的研究受到越来越多的关注.本文分别介绍了基因扩增,两种非同源末端连接修复方式机制及其与基因扩增的研究进展.
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错配修复在DNA双链断裂修复中的作用
DNA双链断裂(DNA double strand breaks,DSBs)是严重的DNA损伤之一,细胞中主要存在两种DSBs的修复途径,同源重组和非同源末端连接.错配修复(mismatch re-pair,MMR)通过纠正在DNA复制和重组过程中产生的碱基错配和插入/缺失错配维持基因组的稳定性.MMR还可招募同源重组中的关键因子,阻止同源重组中异源双链形成重组以及纠正非同源末端连接中形成的错配,因此错配修复参与DSBs的修复并发挥重要作用,保证了修复的准确性.本文综述了错配修复和DNA双链断裂修复的机制,并探讨了错配修复在DNA双链断裂修复中的作用.
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非同源末端连接基因多态性与肿瘤相关性研究进展
非同源末端连接为DNA双链断裂损伤的主要修复途径,通路相关基因在双链断裂的修复过程中的作用已经阐明.非同源末端连接基因的变异会影响其修复能力,导致基因组的不稳定进而引起肿瘤的发生,国内外已有大量关于此方面的病例研究和报道.此文主要就非同源末端连接基因多态性在肿瘤中的研究进展作一综述.
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CDH1基因1018位点突变对乳腺癌非同源末端连接修复途径的影响及作用机理研究
背景与目的:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤.发现并排查乳腺癌的致病突变基因,可能达到防治乳腺癌的目的.本文旨在研究上皮钙黏蛋白编码基因(E-cadherin gene,CDH1)及其1018位点突变型在DNA损伤修复模型中的作用.方法:检测乳腺癌先证者及其家系成员血液DNA样本,发现CDH1基因的1018位错义突变c.1018A>G(p.Thr340Ala)符合遗传学定律,疑似致病突变.在此基础上,构建CDH1基因敲除的MDA-MB-231乳腺癌细胞系,将构建的CDH1-1018突变质粒与非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)报告系统共同转染进入细胞中,通过MTT法检测细胞增殖,采用流式细胞术检测NHEJ报告系统荧光率,反映CDH1基因1018位点突变对DNA损伤修复的影响,后采用蛋白质印迹法(Western blot)对NHEJ修复途径中及乳腺癌相关的关键蛋白进行分子验证.结果:采用CRISPR/cas9系统对CDH1基因进行敲除,成功构建CDH1基因敲除细胞系;将NHEJ报告系统与CDH1基因质粒及CDH1-1018位突变质粒转染进入细胞,经i-sceⅠ酶切,测得CDH1基因1018位突变体细胞株在DNA损伤修复过程中的效率明显降低,Western blot验证了该突变对NHEJ途径重要蛋白以及乳腺癌相关蛋白表达均有抑制作用;MTT实验表明CDH1基因1018位点突变后,细胞增殖效率减缓.结论:CDH1基因1018位点突变对NHEJ修复途径有抑制作用,其机制可能与细胞粘连及组织运动能力相关,抑制相关蛋白的招募过程,使表达减弱.
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用于临床标本的无细胞非同源末端连接检测体系的建立
目的建立一个用于临床标本的体外非同源末端连接的检测体系.方法从白血病细胞株和正常骨髓及外周血细胞中提取的核蛋白在体外与线性质粒pUC18 DNA一起作用,通过琼脂糖凝胶电泳分离和SYBR greenⅠ染色观察其连接能力.结果白血病细胞株NB4、U937、K562、SHI-1、Jurkat的连接能力为10.6%～32.9%,正常骨髓或外周血细胞的连接能力为5.2%～20.0%.结论无细胞的非同源末端连接检测体系的建立是研究人类白血病细胞DNA修复机制的实验基础.
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子宫内膜癌中DNA双链断裂修复的研究进展
基因组不稳定是癌症的特征之一,而细胞DNA损伤应答及其修复机制异常是导致基因组不稳定的重要原因.所有类型的DNA损伤中,DNA双链断裂是严重的一种,DNA双链断裂修复机制与多种肿瘤的发生发展和治疗密切关联,现就子宫内膜癌中的DNA双链断裂修复研究进展做一综述,以期为未来靶向DNA修复通路的研究和治疗提供理论参考.
