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X-射线交错互补修复基因2 C41657T、G4234C多态与卵巢上皮性癌发病风险的关联研究
X-射线交错互补修复基因2(X-ray repair crosscomplementing gene 2,XRCC2)在细胞分裂过程中通过参与同源重组修复DNA链的断裂和交联损伤,具有维持遗传物质稳定性的重要作用[1].XRCC2定位于人体染色体的7q36.1[2].
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DNA双链断裂损伤修复系统研究进展
多种内源或外源因素都能造成细胞基因组DNA损伤,细胞内建立了复杂的修复系统来应对不同形式的损伤.其中DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)作为严重的损伤形式,主要激活同源重组修复(Homologous recombination repair)和非同源末端连接(Non-homologous end joining)通路.这两条通路都是由多个修复元件参与、经过多步反应的复杂过程.两者各具特点、协同作用,共同维护细胞基因组的稳定性.对其分子机制的阐明为肿瘤放化疗的辅助治疗提供了潜在的作用靶点.
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RAD51-G135C和XRCC3-C241T单核苷酸多态性与急性髓系白血病发病相关性研究
目的:探讨RAD51-G135C和XRCC3-C241T单核苷酸多态性与急性髓系白血病(AML)发病的相关性.方法:研究分为两组:AML患者组(545例AML患者的外周血样本)和对照组(1 034名与患者无血缘关系的正常人的外周血样本),分别抽提2组基因组DNA,通过TaqMan探针实时荧光定量PCR技术分析RAD51-G135C和XRCC3-C241T基因多态性,并分析两者多态性与急性髓系白血病发病相关性.结果:与对照组相比,RAD51-G135C纯合变异型(CC)可显著增加AML患者的发病风险(OR =3.07),而RAD51-G135C杂合变异型(GC)与AML发病无统计学相关性.XRCC3-C241T纯合变异型(TT)与AML发病尚无统计学相关性,而XRCC3-C241T杂合变异型(CT)却可增加AML患者的发病风险(OR =0.66).结论:RAD51-G135C纯合变异型和XRCC3-C241T杂合变异型显著增高AML的发病风险,对AML的发病更有预测价值.
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NQO1C609T,RAD51G135C和XRCC3C241T单核苷酸多态性与急性淋巴细胞白血病发病相关性研究
本研究探索NQO1C609T,RAD51 G135C和XRCC3C241T单核苷酸多态性与急性淋巴细胞白血病(ALL)发生的关系.对170例ALL患者和458名与患者无血缘关系的正常人,用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析其NQO1C609T,RAD51G135C和XRCC3C241T基因型.结果表明:在单基因水平分析时NQO1C609T,RAD51G135C和XRCC3C241T基因型比例在正常对照和ALL患者之间无统计学差异,提示其单独作用时对ALL发病的影响无统计学意义.当3个基因联合分析时,NQO1C609T和RAD51G135C均为变异型时伴髓系抗原阳性的ALL和伴平衡易位ALL的发病风险增加(OR值分别为5.553和2.618);NQO1C609T纯合变异型时农村儿童ALL的发病风险增加(OR值为2.541).结论:NQ01C609T、RAD51G135C和XRCC3C241T基因型联合作用可能促进ALL的发病,提示多基因联合分析较单基因对ALL的发病分析可能更有预测意义.
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Ⅲ型家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症易感基因UNC13D参与同源重组修复
本研究从DNA双链断裂同源重组修复角度探讨UNC13D(秀丽新小杆线虫)基因参与Ⅲ型家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 3,FHL3)的发病机制.利用DNA同源重组修复方法,检测正常对照组及UNC13D基因下调后DR-U2OS细胞同源重组修复率的变化情况,并研究此基因的相关功能.结果表明:下调DR-U2OS细胞的UNC13D基因表达后,同源重组修复率较正常对照组明显下降,且差异有统计学意义(P＜0.05),提示UNC13D编码蛋白Munc13-4不仅参与到细胞毒颗粒的胞吐过程中,而且在DNA双链断裂修复中也起作用.结论:UNC13D基因突变可能通过抑制细胞毒颗粒的胞吐和降低DNA双链断裂后的同源重组修复率参与FHL3发病过程,这一研究结果为揭示FHL3的发病机制提供新的理论基础.
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抑制共济失调毛细血管扩张突变基因RAD3相关蛋白逆转卵巢癌SKOV3细胞顺铂耐药
目的 探讨共济失调毛细血管扩张突变基因RAD3相关蛋白(ATR)水平和活性对卵巢癌SKOV3细胞顺铂(DDP)敏感性的影响.方法 以ATR-siRNA转染SKOV3细胞48 h下调ATR蛋白水平,以VE-821预处理SKOV3细胞12 h下调ATR激酶活性.采用CCK8实验检测细胞活性,Western blot法检测ATR、磷酸化组蛋白2A变异体(γ-H2AX)和p-ATR蛋白表达,荧光共聚焦检测细胞γ-H2AX和DNA双链修复蛋白(RAD51)的表达,碱性慧星实验检测细胞内DNA双链损伤情况,流式细胞术检测细胞周期分布.结果 DDP可明显引起SKOV3细胞DNA双链损伤,并激活ATR激酶通路.ATR-siRNA可显著下调ATR蛋白水平.CCK8检测结果显示,NC-siRNA组和ATR-siRNA组经DDP作用48 h后,其半数抑制浓度(IC50)值分别为72.12 μmol/L和41.25 μmol/L(P＜ 0.05).荧光共聚焦检测结果显示,40 μmol/L DDP处理24 h后,ATR-siRNA组RAD51募集明显减少.碱性彗星实验结果显示,与NC-siRNA组比较,ATR-siRNA组能够引起更长的拖尾效应,DNA双链损伤明显增加.DMSO组和VE-821组经DDP作用48 h后,其IC50值分别为75.32 μmol/L和45.64 μmol/L(P＜0.05).荧光共聚焦检测结果显示,40 μmol/L DDP处理24 h后,VE-821组RAD51募集明显减少.碱性彗星实验结果显示,与DMSO组比较,VE-821组能够引起更长的拖尾效应,DNA双链损伤明显增加.细胞周期检测结果显示,40 μmol/L DDP作用于卵巢癌SKOV3细胞24h后,其G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例分别为71.2％、13.4％和15.4％,而对照组分别为54.2％、21.3％和24.4％,DDP引起明显的G0/G1期阻滞.ATR-siRNA组和VE-821组经DDP作用后,其G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例分别为43.2％、20.4％、36.4％和40.2％、22.5％、37.3％,干扰ATR表达和活性后能够逆转DDP引起的细胞周期阻滞.结论 抑制ATR可以影响SKOV3细胞同源重组修复过程,增加DNA双链损伤,缓解G0/G1期周期阻滞,增加其对DDP的敏感性.
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X射线修复交叉互补基因功能的研究进展
对X射线修复交叉互补(XRCC)基因功能的研究极大地促进了对哺乳动物DNA损伤修复过程和遗传不稳定性致癌机制的理解.通过观察XRCC基因突变体的表型,可以对其功能进行鉴定.目前已鉴定的这一基因家族的多数成员均参与几种重要的DNA修复途径,包括碱基切除修复、同源重组修复和非同源末端重接.XRCC基因的鉴定及其在DNA损伤修复和维持遗传稳定性过程中发挥重要的作用.
关键词： X射线修复交叉互补基因 碱基切除修复 同源重组修复 非同源末端重接 -
幽门螺杆菌对胃癌前期阶段胃上皮DNA同源重组修复关键蛋白的影响
目的 通过检测胃癌前期阶段幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori, H.pylori) 阳性和阴性患者胃黏膜组织中DNA损伤标志物γH2AX及同源重组 (homologous recombination, HR) 修复关键蛋白MRE11、Rad51、CtIP表达水平, 评价H.pylori感染在胃癌前期阶段对HR精确修复的影响.方法选择2017年3月至9月行胃镜及病理检测的165例H.pylori阳性和阴性患者, 取胃黏膜上皮组织, 石蜡包埋切片, 行HE染色, 根据世界卫生组织标准和更新的悉尼标准, 划分病理类型.然后应用免疫组织化学染色方法检测H.pylori和DNA损伤标记蛋白及HR修复关键蛋白表达水平, 并行统计学分析.结果 胃黏膜上皮细胞中γH2AX的表达, 在CSG、CAG和IM阶段, H.pylori阳性组表达高于阴性组 (Mann-Whitney U=1116.5, P=0.001;Mann-Whitney U=185.0, P=0.018;Mann-Whitney U=214.5, P=0.041) , 在Dys阶段, H.pylori阳性组和阴性组差异无统计学意义 (Mann-Whitney U=35.5, P=0.964) ;MRE11的表达, 在CSG、CAG阶段, H.pylori阳性组表达高于阴性组 (MannWhitney U=1117.0, P=0.001;Mann-Whitney U=201.0, P=0.002) , 在IM、Dys阶段, H.pylori阳性组和阴性组差异无统计学意义 (Mann-Whitney U=171.0, P=0.568;Mann-Whitney U=41.5, P=0.616) ;Rad51的表达, 在CSG、IM阶段, H.pylori阳性组表达低于阴性组 (Mann-Whitney U=490.0, P=0.002;Mann-Whitney U=73.0, P=0.007) , 在CAG、Dys阶段, H.pylori阳性组和阴性组差异无统计学意义 (Mann-Whitney U=101.0, P=0.404;Mann-Whitney U=24.0, P=0.291) ;CtIP的表达, 在CSG、IM阶段, H.pylori阳性组表达低于阴性组 (Mann-Whitney U=593.0, P=0.044;Mann-Whitney U=58.5, P=0.001) , 在CAG、Dys阶段, H.pylori阳性组和阴性组差异无统计学意义 (Mann-Whitney U=84.0, P=0.136;Mann-Whitney U=18.5, P=0.102) .结论 在胃癌前期发展阶段, H.pylori感染导致人体胃上皮细胞DNA损伤, 却抑制部分HR修复通道关键蛋白表达, 从而可能抑制精确的HR修复, 增加细胞恶变几率.
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同源重组修复与基因组不稳定性
同源重组修复途径极为精确,对于维持基因组的稳定性和完整性至关重要.因此,同源重组修复途径的功能障碍通常会导致严重的基因组不稳定,从而促进肿瘤的发生和演进;但这也可能破坏细胞固有的代谢过程,而成为治疗肿瘤耐药的关键靶点.本文将对同源重组修复的过程、类型及同源重组功能障碍与基因组不稳定性之间的关系加以综述.
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哺乳动物细胞同源重组相关蛋白的研究进展
许多环境因素可以引起DNA分子的损伤,目前已知参与DNA分子损伤修复的机制有两种,非同源性末端连接机制和同源重组机制.在哺乳动物细胞中参与同源重组修复的蛋白主要有Rad51、Dmc1、XRCC2和XRCC3蛋白等.其中Rad51蛋白在各种组织中均有表达,它首先与XRCC3、XRCC5和Rad51C蛋白形成一复合体,在体细胞中复合体与Rad52蛋白结合,修复有丝分裂过程中产生的DNA损伤,而在生殖细胞中与Dmc1蛋白结合,修复减数分裂产生的DNA损伤.
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肠胃清对裸鼠人结肠癌皮下移植瘤DNA双链损伤及同源重组修复因子ATM、γH2AX的影响
目的 研究肠胃清对裸鼠结肠癌皮下移植瘤DNA双链损伤及同源重组修复因子ATM、γH2AX的影响.方法 构建裸鼠人结肠癌细胞HCT116皮下移植瘤模型,分为空白组、L-OHP组、肠胃清组、肠胃清联合L-OHP组(联合组),分别采用NaCl溶液、L-OHP、肠胃清、肠胃清联合L-OHP干预.运用彗星扫尾实验检测DNA损伤程度,Western blot及免疫组化法检测同源重组修复因子ATM、γH2AX的表达.结果 与空白组比较,肠胃清组、L-OHP组和联合组均出现细胞拖尾现象,其中联合组细胞拖尾现象明显(P＜0.05).与空白组比较,L-OHP组和联合组DNA同源重组修复因子ATM、γH2AX蛋白表达明显上调(P＜0.05);与L-OHP组比较,联合组ATM、γH2AX蛋白表达明显下调(P＜0.05,P＜0.01).结论 肠胃清联合L-OHP组中DNA双链断裂损伤严重,提示肠胃清可增强L-OHP的疗效,其作用机制是减少结肠癌细胞对化疗损伤的同源重组修复作用.
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肿瘤BRCA1亚细胞定位对细胞放射线及PARP抑制剂敏感性的影响
目的 探讨肿瘤BRCA1细胞内定位对放射线和PARP抑制剂敏感性的影响.方法 采用siRNA干扰抑制乳腺癌细胞株MCF7内源性BRCA1表达,转染BRCA1细胞内定位不同的载体:pCMV-3xFlag-WT-BRCA1、pCMV-3 xFlag-NES-BRCA1、pC-MV-3xFlag-NIS-BRCA1.采用免疫荧光法检测BRCA1的细胞定位及细胞核γ-H2AX和Rad51核焦点形成,应用流式细胞技术检测细胞凋亡,克隆形成实验检测体外细胞存活.结果 转染WT-BRCA1有47％细胞核表达,23％细胞质表达,30％细胞质和细胞核均表达,NES-BRCA1 mutant表达主要定位于细胞核(87％);NLS-BRCA1 mutant定位于细胞质(82％).WT-BRCA1、NES-BRCA1 mutant和NLS-BRCA1 mutant三种载体转染的细胞4 Gy放射处理后2h,Rad51核焦点阳性细胞数分别为87％、84％及13％;放射后24 h,γ-H2AX核焦点阳性细胞分别为22％、25％及59％.NLS-BRCA1 mutant转染细胞较WT-BRCA1和NES-BRCA1 mutant转染细胞ABT-888和放射处理后诱导的凋亡细胞增加,克隆存活减少.结论 BRCA1的细胞内定位影响DNA双链断裂同源重组修复,并可预测肿瘤对放射和PARP抑制剂的敏感性.
关键词： BRCA1亚细胞定位 同源重组修复 放射 PARP抑制剂 -
DNA 同源重组修复与乳腺癌的研究进展
双链断裂是真核细胞严重的DNA损伤类型，主要依赖同源重组途径进行修复。 BRCA1／2是该修复通路中的关键因子，以其为核心组成的BRCA肿瘤抑制因子网络中多种致病性突变均可损伤基因组完整性和稳定性，增高乳腺癌易感性。该文结合新研究进展，对DNA同源重组修复网络中关键基因突变与乳腺癌易感性及个体化治疗策略进行综述，旨在促进相关突变携带者的乳腺癌早期预防、分子诊断和精准治疗。
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Dicer1在卵巢癌间质成纤维细胞中调控DNA损伤修复相关基因
目的：：检测Dicer1在卵巢癌间质肿瘤相关成纤维细胞中的表达情况,探讨其对DNA 双键断裂损伤( DSB )修复相关基因的影响。方法：应用基因集合富集分析(GSEA)方法分析卵巢癌间质和正常卵巢间质基因表达公共数据库GSE40595,探索Dic-er1对DSB修复相关通路及关键基因的调控作用,并筛选出相关差异基因。应用重组人转化生长因子β1( hTGFβ1)细胞因子诱导成纤维细胞系MRC5细胞活化成为肿瘤相关成纤维细胞( CAFs),即MRC5-CAFs。以靶向Dicer1基因的siRNA转染MRC5-CAFs,下调其Dicer1表达水平。 qRT-PCR、Western blot 法分别检测 Dicer1及分析所得相关基因,如XRCC6、TP53 BP1、H2 AFX、BRCA1、ATR、RAD51 mRNA水平及Dicer1和DSB损伤修复关键基因γ-H2AX(磷酸化H2AX)、RAD51蛋白水平。荧光共聚焦检测细胞核蛋白γ-H2AX表达；采用CCK8试验检测细胞活性。结果：GSEA分析结果显示,Dicer1表达水平与DSB (NES=1.7942109,FDRq=0.0067545176)及DNA损伤修复(NES=2.4433048,FDRq=0)显著正相关,进一步通过相关分析筛选出在上述通路中与Dicer1表达正相关的显著基因集。沉默MRC5-CAFs细胞中Dicer1表达后,DSB相关基因,如XRCC6、TP53BP1、H2AFX及损伤修复相关基因BRCA1、ATR、RAD51均较对照组显著下降,与GSEA分析结果一致。荧光共聚焦显微镜检测到沉默Dicer1 MRC5-CAFs细胞内聚集较少的DSB。 CCK8试验结果显示,MRC5-CAFs细胞在20μmol/L顺铂作用下,Dicer1-si组不同时间梯度的细胞活性率均低于NC-si组。结论：Dicer1在卵巢癌间质成纤维细胞中正向调控DNA损伤修复相关基因,抑制Dicer1表达后其对顺铂敏感性显著增加。
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ATM对卵巢癌细胞株CaOV3顺铂敏感性的影响
目的：：探讨ATM激酶表达水平和活性对卵巢癌细胞CaOV3顺铂敏感性的影响，以及可能的机制。方法：以ATM-siRNA转染CaOV3细胞48 h下调ATM蛋白水平，以KU-55933预处理CaOV3细胞12 h 下调ATM 激酶活性。 CCK8试验检测细胞活性， Western blot法检测ATM及r-H2 AX蛋白表达，荧光共聚焦confocal检测细胞DNA双链损伤标志蛋白r-H2 AX表达及同源重组修复关键蛋白RAD51表达及两者细胞核中共定位，应用碱性慧星试验检测细胞内DNA双链损伤情况，流式细胞术检测细胞周期分布。结果：卵巢癌细胞系CaOV3具备相对完整的同源重组修复能力，下调ATM或抑制ATM激酶活性均可降低DNA双链损伤情况下的同源重组修复能力，增加其对cDDP敏感性，同时减少cDDP引起的G0/G1期周期阻滞。结论：抑制ATM可影响卵巢癌细胞同源重组修复过程，增加DNA双链损伤，缓解G0/G1期周期阻滞，增加其对顺铂敏感性。
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放射线诱导BRCA1出核效应对PARP抑制剂的增敏作用
目的 探讨放射线诱导的乳腺癌1号基因(BRCA1)出核效应对同源重组介导的DNA双链断裂损伤(DSB)修复功能的影响及对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂的增敏作用.方法 采用亚细胞纯化及蛋白印迹法检测乳腺癌细胞株MCF7经放射线处理后BRCA1的亚细胞定位,同时采用免疫荧光法检测细胞核磷酸化的H2AX组蛋白(γ-H2AX)、Rad51核焦点形成.流式细胞技术检测细胞凋亡、克隆形成实验检测体外细胞存活情况,并制作裸鼠皮下移植瘤模型,分为4组,分别为:对照组、放射+DMSO组、假照+ABT-888(ABT-888为PARP抑制剂)组、放射+ABT-888组,每5 d为1个治疗周期,周期第1天给予2 Gy照射或假照射.第2~5天给予溶剂(对照组、放射+DMSO组)或20 mg/(kg·d)的ABT-888(假照+ABT-888组),总共给予4个周期的治疗.检测各组的体内抑瘤作用.结果 经4 Gy放射处理后,MCF7胞核BRCA1表达量减少,仅为对照组的41%,但胞浆内表达量明显增多,是对照组的2.14倍(P<0.01);同时MCF7细胞经4 Gy放射处理后ABT-888诱导的Rad51核焦点形成阳性细胞也较对照组明显减少(7%vs.30%,P=0.01).放射线和ABT-888联合应用导致MCF7细胞凋亡率增高(19%),与对照组(5%)、放射+DMSO组(9%)或假照+ABT-888组(6.2%)相比较差异有统计学意义(P<0.01).裸鼠移植瘤模型中放射+ABT-888组对肿瘤生长抑制作用明显优于假照+DM-SO组或假照+ABT-888组(P<0.01).结论 放射线可诱导BRCA1出核并增强PARP抑制剂的抗肿瘤作用.
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利用CRISPR/Cas9系统检测同源片段长度对重组效率的影响
目的:在大肠埃希菌中利用CRISPR/Cas9系统对插入失活的mCherry红色荧光报告基因进行靶向切割并重组,以研究同源片段长度对重组修复效率的影响.方法:通过Golden Gate克隆方法构建Cas9表达质粒pKD46-Cas,转化至大肠埃希菌DH5α中,阿拉伯糖诱导表达Cas9蛋白,Western blot检测蛋白表达.用同样的方法,将一段随机靶标序列引入pTac-mCherry-3guid质粒中,造成插入失活,同时在插入序列两侧分别预留0、40、80、120 bp的mCherry编码区overlap序列,构建出含不同长度同源片段的插入失活mCherry荧光报告质粒pQ0、pQ40、pQ80、pQ120,并将其分别转化到表达Cas9蛋白的大肠埃希菌DH5α中,对应的细菌平板分别为pQ0组、pQ40组、pQ80组及pQ120组,每组各9个平板,对每个平板的红、白色菌落进行计数,分别计算出红色菌落数/菌落总数的比值,即为重组修复效率.结果:PCR及测序证实pKD46-Cas质粒及插入失活的mCherry荧光报告载体pQ0、pQ40、pQ80、pQ120构建成功,Western blot鉴定pKD46-Cas在大肠埃希菌DH5α中表达Cas9蛋白;红色菌落计数显示pQ0组为0,其余3组均出现红色菌落,4组重组修复效率的差异有统计学意义(P＜0.05),重组修复效率与同源片段长度呈正相关(r=0.792,P＜0.01).结论:成功建立了基于mCherry红色荧光报告基因和Cas9的同源重组效率检测系统;研究表明不包含同源片段的质粒无法进行有效的重组,当同源片段在0～120 bp时其长度对重组效率有影响.此系统为深入研究原核生物的同源重组提供了一个新的技术平台.
关键词： CRISPR/Cas9 同源重组修复 基因编辑技术
