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DNA疫苗非病毒载体的研究进展
DNA疫苗(DNA vaccine)又称为核酸疫苗或基因疫苗,是将编码特异性抗原的基因构建在表达性质粒中,经某种方法导入体内后,利用宿主细胞表达系统合成相应的病原体蛋白,诱导机体产生免疫应答以达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗自1990年发现以来,因具有良好的安全性及可诱导广泛的体液免疫和细胞免疫,已越来越受到人们的关注,是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗,在人和动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫病及肿瘤性疾病等领域发挥作用.
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基因疫苗研究为制药业注入新的活力
各种疾病都要以预防为主,这是人类多年来的追求.自2006年美国食品药品监督管理局(FDA)批准宫颈癌疫苗上市以来,各种疾病基因疫苗的研究进展迅速.
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腺病毒载体构建原理与方法的研究进展
由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用多的病毒载体之一.为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作.本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下.
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ICAM-1基因修饰的日本脑炎DNA疫苗诱导BALB/c鼠脾脏树突状细胞功能的研究
细胞间黏附分子-1( intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)在基因疫苗方面已有研究报道,有学者研究表明ICAM-1能提供给T细胞共刺激信号,并且证实该刺激信号通路独立于CD86介导的T细胞活化的第二信号通路。
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全反式维甲酸对基因免疫应答的调节作用
目的研究全反式维甲酸(ATRA)对TR421-hCGβ质粒基因免疫诱生的特异性细胞免疫与体液免疫应答的调节作用.方法肌肉注射重组质粒TR421-hCGβ DNA(每只鼠50μg/100μl)初次免疫小鼠,以灌胃的方式给予ATRA,并以灌溶剂和TR421质粒免疫为对照;3周与6周后经同样的方式加强免疫各组小鼠,采用ELISA方法对基因免疫小鼠血清中IgG抗体水平进行动态观察,分析小鼠血清中IgG抗体亚类;3H-TdR掺入法测定特异性细胞增殖和细胞杀伤功能.结果 ELISA结果表明,TR421-hCGβ质粒基因免疫诱生较高的抗hCGβ抗体水平,ATRA增强TR421-hCGβ质粒基因免疫诱生的抗hCGβ特异性IgG抗体水平并且伴随IgG2a/IgG1显著性降低;TR421-hCGβ质粒基因免疫诱生较强的淋巴细胞增殖活性和CTL活性,ATRA抑制TR421-hCGβ质粒基因免疫诱生的特异性细胞增殖和细胞杀伤功能.结论 ATRA促进基因免疫诱生的TH2免疫应答,抑制TH1型免疫应答,为改变基因免疫诱生的特异性免疫应答类型提供了一条新的途径.
关键词: 全反式维甲酸(ATRA) 基因疫苗 Th细胞 -
SARS-CoV核衣壳蛋白抗原性鉴定和基因免疫研究
目的了解SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的抗原性及其基因疫苗的免疫原性.方法用大肠杆菌表达SARS-CoV的N蛋白,用SARS患者恢复期血清对其进行抗原性鉴定.再构建N蛋白基因疫苗,肌肉注射接种小鼠,检测小鼠血清中的抗N蛋白IgG抗体、脾细胞增殖和迟发型超敏反应.结果大肠杆菌重组表达的SARS-CoV N蛋白具有强抗原性,其基因疫苗能在小鼠有效诱导N蛋白特异性抗体和CD4+、CD8+ T淋巴细胞免疫应答.结论 SARS-CoV的N蛋白可作为重要的SARS血清学诊断抗原,并对于SARS的特异性预防和治疗有潜在的应用价值.
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IL-12、IL-18基因对HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导的免疫应答的影响
目的研究IL-12、IL-18基因对HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导免疫应答的影响,以探求HIV-1核酸疫苗的新策略.方法 pVAX1GP120联合IL-12、IL-18基因或者pVAX1GP120单独免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ水平,以MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖,用乳酸脱氢酶(LDH)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答.结果与pVAX1GP120免疫组比较,pVAX1GP120联合IL-12、IL-18基因免疫组小鼠血清的抗HIV-1 gp120抗体滴度升高,IFN-γ升高,小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 IL-12、IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,有可能增强特异性TH1细胞和CTL反应,IL-12、IL-18基因对体液免疫可能有抑制作用.因此,IL-12、IL-18基因对于治疗性HIV-1核酸疫苗可能是具有较好应用前景的免疫佐剂.
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淋病奈瑟菌NspA基因疫苗诱导小鼠特异性体液免疫应答
1999年Martin等首先克隆了淋病奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)基因,发现其在细胞表面持续表达,菌株之间NspA氨基酸序列的同源性高达98%,提示NspA可能是研制淋病疫苗的理想抗原.我室已成功构建NspA真核表达载体pcNspA,本文研究了pcNspA基因免疫在小鼠体内诱生特异性抗体的作用.
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结核分枝杆菌含信号肽的Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗免疫保护效果研究
目前人类预防结核病的惟一疫苗棗卡介苗(BCG)存在着不足,研制新型、有效、安全的预防结核病的疫苗成为国内外学者共同关注的一个重要课题.目前由于大多数结核病DNA疫苗的免疫保护效果尚不如BCG,因此,提高DNA疫苗免疫效力是目前结核病核酸疫苗研究的热点.本研究选择新近从结核杆菌培养滤液(CF)中纯化分离出的一种低分子量蛋白抗原棗含信号肽的Mtb8.4(MS)作为目的抗原,与人白细胞介素12(hIL-12)构建成结核病嵌合基因疫苗,旨在提高MS的免疫效力.
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PELA作为防龋基因疫苗投递系统的体外研究
为了解聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)作为防龋基因疫苗的投递系统的可行性、有效性和安全性,作者用PELA包被本室构建的防龋基因疫苗pEGFPC1-pacA,对DNA/PELA微球制备方法、微球特征以及体外转染进行了初步研究.
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变异链球菌表面蛋白质抗原真核表达质粒的构建及免疫动物的研究
变异链球菌(Streptococcus mutans, S.mutans)是龋病主要致病菌,S.mutans的表面蛋白质抗原PAc是其主要毒力因子之一,参与了唾液介导的S.mutans在牙面的粘附。S.mutans PAc分子的氨基端不仅富集免疫显性T、B细胞表位,而且含有唾液糖蛋白结合区,因此氨基端是理想的表位多肽防龋疫苗选择区。此外,Streptococcus sobrinus(S.sobrinus)的PAg分子与S.mutans PAc分子的氨基端具有保守的B细胞表位,以PAc分子该区段制备的多肽疫苗可激发宿主对S.sobrinus的交叉保护性反应。因而,初次以变异链球菌表面蛋白质抗原PAc氨基端的编码基因构建真核表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察所诱导的体液免疫应答,为基因疫苗防龋的动物实验提供资料。
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MUC1/Y基因真核表达载体构建及MUC1、MUC1/Y体外修饰DC诱导特异性抗肿瘤免疫应答
目的构建MUC1/Y全长cDNA真核表达载体,并以MUC1及MUC1/Y真核表达载体修饰树突状细胞(DC)诱导特异性抗肿瘤免疫.方法构建MUC1/Y DNA真核表达载体,选取10例HLA-A2乳腺癌患者,体外IL-4、GM-CSF联合诱导DC,并以pCDNA3.1-MUC1和pCDNA3.1-MUC1/Y转染DC,同时以空载体为对照,以pIRES2-EGFP-MUC1/Y观察转染效率,转染后DC与自体T细胞混合培养,诱导CTL.以MCF-7为特异性靶细胞,Raji为非特异性靶细胞,通过乳酸脱氢酶释放实验检测杀伤活性,以anncxin V-FTTC检测特异性CTL诱导靶细胞凋亡的情况.以ELISA法测定基因修饰后DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ的能力.结果酶切鉴定及测序结果表明成功构建了MUC1/Y真核表达载体pIReS2-EGFP-MUC1/Y和pCDNA3.1-MUC1/Y.pIRES2-EGFP-MUC1/Y转染效率基本为10%左右,DC中MUC1表达率为8%.杀伤实验表明T-DC-pCDNA3.1-MUC的杀伤活性为64%,T-DC-pCDNA3.1-MUC1/Y为46%.这两组间差异有显著性,同时与对照组比较差异均有显著性.annexin V-FTTC标记实验显示,T-DC-pCDNA3.1-MUC1对靶细胞的杀伤和诱导凋亡的能力显著高于T-DC-pCDNA3.1-MUC1/Y及对照组.基因修饰DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ的能力显著升高.结论构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-MUC1/Y可用于真核细胞转染并观察转染效率,易于筛选阳性克隆.经pCDNA3.1-MUC1及pCDNA3.1-MUC1/Y修饰的DC可有效诱导特异性免疫应答.
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接头长度对MDC与CVB3VP1融合基因疫苗免疫效果的影响
目的 构建表达不同接头(linker)长度的巨噬细胞源趋化因子(MDC)与CVB3VP1融合基因疫苗,观察接头长度对融合基因疫苗免疫效果的影响.方法 构建表达接头长度分别为10、15和19个氨基酸的重组质粒pcDNA3/MDC-L-VP1;将6~8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为A~E5组,分别肌肉注射pcDNA3、pcDNA3/VP1、pcDNA3/MDC-L10-VPl、peDNA3/MDC-L15-VP1和peDNA3/MDC-L19VP1,每次接种100μg/只,4周注射1次,共3次,每次免疫后第14天眼眶静脉采血,用微量中和试验滴定血清中和抗体效价.第3次免疫后3周,每组取3只小鼠,制备脾细胞,用CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性;每组取3只小鼠以3LD50CVB3病毒攻击,第7天取血处死,检测血中病毒滴度.结果 成功构建了3种不同接头长度的质粒;第3次免疫后,E组中和抗体滴度和小鼠脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性显著高于其他各组,血中病毒滴度显著低于其他各组(P<0.01).结论 融合基因疫苗pcDNA3/MDC-L19-VP1能诱导小鼠对CVB3VP1产生较强的体液和细胞免疫,有效地抑制了病毒的增殖.
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基因治疗在传染病防治中的应用研究进展
传染病是目前人类所面临的一类重大疾病,在某些疾病状态下,人类还未寻找到理想的治疗方法,如病毒感染等.现代基因治疗是指对致病基因的修正和基因增强及采用外源性细胞因子基因、核酶、反义核酸类基因药物进行疾病治疗的方法.经过20多年的发展,技术逐步走向成熟,在传染性疾病的防治中显示了重大的临床应用前景.传染性疾病的基因治疗包括:基因疫苗、RNA干扰、胞内抗体等.
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腺病毒载体的特点及其在HCV研究中的应用
由于腺病毒(adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青眯,成为当前使用多的病毒载体之一.为了克服其存在的不足并取得更满意的效果,人们在腺病毒载体的构建和改进方面做了大量的工作.本文谨就腺病毒分子生物学特点、腺病毒载体的优缺点、近年来腺病毒载体构建原理与方法的改进及其在HCV研究中的应用进展作-扼要综述.
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热休克蛋白家族与肝癌的关系
热休克蛋白HSP是一种广泛存在于微生物和动植物体内的一种应激蛋白.HSP在HCC的生物治疗中将发挥越来越重要的作用.HSP在生物体内起着参与加速降解和清除细胞代谢产物,维护细胞的功能和生存,协同免疫应答,调节信号传导通路,调控细胞周期,抑制凋亡以及促进微管的形成与修复等作用.大量研究显示一些HSP在肿瘤免疫中发挥作用,并有望制成基因疫苗应用于肿瘤的防治.本文综述了HSP70,HSP90,HSP47,HSP27等在肝癌的发生、发展和治疗中的进展及其在肝癌防治中的意义.
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融合表达HBsAg/HBcAg的重组质粒诱导的小鼠免疫应答
目的:探讨融合表达HBsAg/ABcAg的重组质粒的免疫诱生效果方法:从乙肝患者的血清中提取HBV DNA,采用pCR技术扩增HBV的S和C基因并拼接成SC片段.构建融合表达质粒pcDNA3.1-SC,以100μg肌肉接种BALB/c小鼠,2,4 wk后各加强1次.采用ELISA法检测小鼠血清抗-HBs和抗-HBc,LDH释放法检测体外CTL活性.结果:接种后3,5,8,12 wk,小鼠血清抗-HBs阳性率分别达到50%,75%,100%和50%,抗-HBs滴度在第8 wk达到峰值.而抗-HBc阳转率低于25%,抗体高滴度低于1:5.小鼠接种后5 wk时的特异性CTL活性为46.9±1.8%(效/靶比100:1).结论:融合表达质粒pcDNA3.1-SC能够同时诱生针对HBsAg/HBcAg的特异性细胞免疫和体液免疫应答,提示研制乙肝的免疫预防和治疗性基因疫苗的可能性.
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基因疫苗的基础研究及应用现状
基因疫苗已成为疫苗研究领域中的热点之一,特别是其研究方向与世界卫生组织儿童免疫长远目标-用一种疫苗预防多种疾病相吻合.从效力到成本的潜在优点已使基因疫苗成为今后疫苗制造的选择,故澳大利亚昆士兰医学所的Waine和McManus在
上论证,基因疫苗为第三次疫苗革命.令人鼓舞的是艾滋病和T细胞淋巴瘤的基因疫苗已进入到了临床前阶段.基因疫苗不仅能预防某些传染病,还可做为治疗用疫苗来治疗一些复杂难治的疾病,例如病毒性肝炎、癌症等.这些均已显示出基因疫苗的巨大潜力和应用前景.但是,基因疫苗的历史毕竟很短,实验结果均来自动物,在用于人体之前还有许多工作必须完成,其中重要的是解决基因疫苗对人体的安全性和效力问题,例如:(1)须用与人类疾病相关的动物模型证实其效果;(2)须用高度敏感的PCR技术等确证所注射的DNA不与宿主细胞基因组DNA整合,这是确保DNA疫苗遗传学安全性的重要指标之一;(3)终还需要近期和长期的临床试验以明确其毒副作用和免疫保护效果.我国已制定了基因转移治疗的管理条例,基因免疫作为预防性基因治疗技术,同样应遵守此条例,这样才有利于基因治疗的健康发展. -
IL-12及HBV基因疫苗共同免疫小鼠的效果
目的观察编码鼠IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的影响.方法肌肉注射DNA疫苗,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性.结果免疫8wk后,注射pCR3.1组、注射pCR.1-S组及共注射IL-12真核表达载体的血清A(OD值)分别为0.04±0.01,0.87±0.1及1.67±0.15.CTL细胞杀伤活性分别为10.1%±6.4%,50.5%±6.4%及73.3%±8.8%,后两组与pCR3.1组比较均有显著差异(P<0.01),后两组比较均有显著差异(P<0.01).脾细胞悬液经抗CD4+单克隆抗体处理后分别为48.3%±5.9%,75.6%±9.1%,抗CD8+单克隆抗体处理后分别为10.6%±1.4%,16.9%±2.3%.结论 IL-12的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答,CTL细胞杀伤活性主要由CD8+执行.基因疫苗可能用于预防及治疗HBV感染.
关键词: 基因疫苗 小鼠 乙型肝炎病毒表面抗原 白细胞介素-12 真核表达载体质粒 -
MUC1基因免疫抑制H22肝癌生长的实验研究
目的:观察MUC1基因免疫对H22肝癌生长的特异性抑制作用.方法:采用股四头肌肌肉注射法将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1-MUC1免疫Balb/c小鼠,每次100μg,3wk/次,共3次.后一次基因免疫后3 wk,接种表达MUC1的H22肝癌细胞.2 wk后观察、记录肿瘤的生长情况.于肿瘤细胞接种后43d,处死全部动物,称肿瘤的质量.荷瘤小鼠的瘤组织常规HE染色.结果:肿瘤细胞接种后43d,MUC1预防组,质粒pcDNA3.1对照组及生理盐水阴性对照组H22肝癌大小分别为547±59 mm3,1185±84mm3和1220±95 mm3(P<0.01);平均瘤质量分别为1.87±0.96 g,4.19±1.34 g和4.23±1.32 g(P<0.01);pcDNA3.1对照组和生理盐水阴性对照组100%可见瘤体形成,肿瘤生长,而MUC1基因疫苗预防组仅见50%(5/10)的小鼠有瘤体形成,与对照组相比,MUC1预防组H22肝癌生长受到明显抑制(P<0.01);MUCI预防组小鼠免疫保护有显著差异(P<0.05).病理学检查结果显示,与pcDNA3.1对照组相比,MUC1 DNA疫苗预防组鼠H22肝癌组织大量坏死.结论:MUC1基因免疫显著抑制H22肝癌生长.