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减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的鸡传染性支气管炎病毒s1基因DNA疫苗及其免疫效力研究
为研制鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗,构建和表达了运送鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌.首先将鸡传染性支气管炎病毒M41株的全长s1基因插入到嵌合CpG DNA的真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1-CpG.然后将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建出运送DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1-CpG).将重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)分别以1×109 CFU,5×109 CFU,1×1010 CFU的剂量滴鼻和口服接种4日龄雏鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果表明重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)具有良好的安全性.在免疫后35 d,商品鸡体重测定结果表明重组菌免疫不影响鸡体增重.以5×109 CFU重组菌滴鼻和口服两次接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,二免3周后,血清抗体和小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组抗体水平与空白对照组、空载体对照组之间分别存在极显著性差异(P＜0.01).攻毒试验结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组有较高的免疫保护效力,与灭活苗和减毒苗效力相当,显示出一定的应用前景.
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稳定携带新城疫病毒DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性
采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F中扩增出新城疫病毒JS5株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1+中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-F.通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pmcDNA3.1-F).体内、体外试验结果表明,重组质粒pmcDNA3.1-F在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-F.将重组菌SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)分别以1×109 CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和黏膜抗体.重组菌以5×109 CFU剂量两次口服免疫4日龄SPF鸡,免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和小肠黏膜抗体效价水平与空载体组之间存在显著性差异(P＜0.05).免疫保护试验结果显示,SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P＜0.05),且SL7207(pmcDNA3.1-F)免疫组的保护率较SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组提高了20.0%,说明稳定携带新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性.
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减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的实验免疫效果研究
将运送H5亚型禽流感病毒DNA疫苗重组减毒鼠伤寒沙门氏菌以1.0×1010CFU剂量口服接种1日龄SPF雏鸡,结果表明重组菌对雏鸡具有良好的安全性.将重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA) 以2×109CFU的剂量两次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,同时,将重组菌分别与pVAX1-IFN-γ或pVAX1-IL2(200μg/只)联合免疫,通过测定小肠粘膜抗体效价,结果显示,重组菌单独免疫组和联合免疫组能激发机体产生粘膜免疫应答,且与空载体组、空白对照组以及油苗组之间存在显著性差异(P＜0.05).攻毒后,免疫保护结果显示无论是重组菌单独免疫组还是联合免疫组均与空载体组和空白对照组之间存在显著性差异(P＜0.05),而重组菌单独免疫组与联合免疫组之间不存在显著性差异,说明重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)能够提供机体抵抗HPAIV H5亚型强毒攻击的良好的免疫保护作用,这为进一步筛选出基于粘膜免疫途径的新型禽流感基因工程疫苗奠定了基础.
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共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-2基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力研究
将H5亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因和鸡白介素(chiIL-2)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体p12LS的启动子Ps和P_(E/L)下游,使这两个基因反向串联,构建携带AIV HA基因和chiIL-2基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒p12LSH5AIL2.将重组鸡痘病毒转移载体质粒转染至已感染野生型鸡痘病毒282E4株的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,经蓝斑筛选获得纯化的重组鸡痘病毒rFPV-H5AIL2.间接免疫荧光试验表明重组鸡痘病毒能够表达H5亚型AIV HA;RT-PCR和间接免疫荧光试验证实重组鸡痘病毒可表达chiIL-2.SPF鸡和商品蛋鸡的免疫攻毒保护试验表明,经rFPV-H5AIL2免疫的试验鸡的抗体水平显著高于经rFPV-H5A免疫的试验鸡;在SPF鸡中rFPV-H5AIL2免疫组和rPFV-H5A免疫组的攻毒保护率和排毒率相当,但在商品鸡中rFPV-H5AIL2免疫组的攻毒保护率显著高于rFPV-H5A免疫组,而排毒率显著低于后者.本研究为研制新型禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础.
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表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应
为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2.利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2.分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRVHB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免.一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒.结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用.结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株.
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结核分枝杆菌含信号肽的Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗免疫保护效果研究
目前人类预防结核病的惟一疫苗棗卡介苗(BCG)存在着不足,研制新型、有效、安全的预防结核病的疫苗成为国内外学者共同关注的一个重要课题.目前由于大多数结核病DNA疫苗的免疫保护效果尚不如BCG,因此,提高DNA疫苗免疫效力是目前结核病核酸疫苗研究的热点.本研究选择新近从结核杆菌培养滤液(CF)中纯化分离出的一种低分子量蛋白抗原棗含信号肽的Mtb8.4(MS)作为目的抗原,与人白细胞介素12(hIL-12)构建成结核病嵌合基因疫苗,旨在提高MS的免疫效力.
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增强核酸疫苗免疫效力的策略及相关机制
核酸疫苗(基因疫苗)是继死疫苗、活疫苗、蛋白质疫苗及亚单位疫苗后的新一代疫苗,具有多方面的优点,如:可同时激发体液和细胞免疫应答,可将挑选的多种基因联合为一个疫苗,使用安全,易于生产和运输等,但体内表达水平及免疫效力低却成为阻碍其广泛应用的严重障碍.近几年来,科研人员研究了一些提高其效力的策略,现综述如下:
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真核细胞表达质粒pCMV4增强hCGβ-C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力
目的:比较以pCMV4和pcDNA3为载体的hCGβ-C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力.方法:分别构建 pcD-NA3-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ-C3d3真核细胞表达质粒,并转染真核细胞瞬时表达系统COS-7细胞,以分析体外表达效率.抽提与纯化pcDNA3、pcDNA3-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ-C3d3质粒.对6周龄BLAB/C小鼠行DNA免疫.于末次免疫后6周采血,用间接ELISA分析实验动物外周血抗hCGβ抗体效价.结果:对COS-7体外表达效率分析,由pCMV4介导的hCGβ-C3d3表达效率明显高于pcDNA3.动物DNA免疫结果,pCMV4-hCGβ-C3d3刺激动物机体产生的免疫应答强度及免疫效果显著高于pcDNA3-hCGβ-C3d3.结论:pCMV4真核表达质粒hCGβ-C3d3体外表达效率及动物DNA免疫效力均显著高于pcDNA3真核表达质粒.
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自我复制性核酸疫苗
迄今,核酸疫苗免疫诱导效力偏低,是限制其实际应用的原因之一.尽管目前发展了许多策略,在不同程度上提高了核酸疫苗的免疫效力,但仍然未达到可供实用化的理想效果.而且,质粒载体长期在宿主细胞中存留,存在着可能与宿主细胞染色体DNA随机整合和细胞转化的潜在危险[1].此外,外源基因在体内长期高水平表达,可能会刺激机体产生抗DNA抗体,导致自身免疫病或免疫耐受等问题[2].所以,提高核酸疫苗在机体内的表达水平,加强其免疫效力,同时又能保证核酸疫苗的安全性,已成为核酸疫苗研究中的关键问题.
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hsp70/CD80嵌合DNA疫苗对结核杆菌感染的免疫预防效果
卡介苗(BCG)虽然是全球使用广泛的预防结核的疫苗,可预防和减轻儿童的重症结核,但对成人肺结核的保护效果不稳定.DNA疫苗为结核的防治提供了新的思路.人们试图用嵌合DNA疫苗和DNA疫苗的联合免疫来提高对结核病的免疫保护效果.分支杆菌热休克蛋白70(hsp70)包含多个T细胞和B细胞表位,免疫原性非常强,具有免疫优势抗原的特点,能诱导出特异性Th1型细胞反应,对结核杆菌的攻击可产生较强的保护性免疫效应,但单独的hsp70 DNA疫苗的免疫保护效果不能超过BCGCD80是近年来发现的一种具有免疫活化功能的第二信号分子,与其共刺激受体CD28/CTLA-4间相互作用可提供T细胞活化所必需的协同刺激信号,本研究将结核杆菌hsp70和人CD80的编码基因进行连接重组,制备成结核病hsp70/CD80嵌合DNA疫苗,可望提高hsp70 DNA疫苗的免疫效力,获得免疫原性更强、安全可靠的新型结核病疫苗.
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禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗设计、表达制备及动物实验研究
目的 设计并获得一种安全、高效,并能对以H5N1亚型为主的多种禽流感病毒亚型产生保护的复合基因工程疫苗.方法 利用分子生物学和分子免疫学方法对国内以及周边国家流行的禽流感毒株进行全面分析,利用生物信息学技术合理设计亚单位加表位的全新复合结构疫苗的氨基酸序列；利用大肠杆菌密码子优化技术根据疫苗氨基酸序列获得基因序列；通过全基因合成的方法获得该疫苗的基因,并通过大肠杆菌表达系统对该疫苗进行表达；目的蛋白经过包涵体洗涤和色谱纯化后复性；通过ELISA评价其抗原特异性,并乳化制备成禽流感蛋白疫苗,通过小鼠体内免疫试验检测其免疫效力.结果 设计了包含通用性的辅助性T细胞表位、B细胞表位以及CTL表位的串接疫苗结构；全基因合成获得了该复合疫苗的基因序列；该基因在大肠杆菌表达系统中得到了高效表达,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白30％；经过粗纯和精纯后的目的蛋白纯度达到95.5％,复性后获得可溶性蛋白溶液,浓度可达2.4 mg/mL.结论 通过小鼠实验,验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性,证实该基因工程疫苗在免疫小鼠体内激发体液免疫的同时调动了细胞免疫.小鼠免疫试验证明,该疫苗可以在小鼠体内有效诱发免疫应答.
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狂犬病基因工程灭活疫苗(Hep-Flury-dG株)的免疫效力
目的 检测狂犬病基因工程灭活疫苗(Hep-Flury-dG株)注射犬只后的免疫效力.方法 在广州市增城区某村进行狂犬病基因工程灭活疫苗(Hep-Flury-dG株)环境释放试验,登记该村所有家养犬的信息并存档,同时进行疫苗免疫.随机采集免疫前血清样品66份,免疫后21 d仍获得血清样品66份,使用ELISA方法检测样品的抗体水平.结果 免疫前该村犬只抗体阳转率为26％,免疫后21 d抗体阳转率达到83％.经统计分析表明免疫前后抗体水平差异具有统计学意义；性别不是影响抗体水平变化的因素,但年龄可影响抗体水平变化,成犬抗体水平的增加明显高于幼犬.结论 狂犬病基因工程灭活疫苗(Hep-Flury-dG株)免疫犬只后可提供足够的保护力,有效保护犬只免受狂犬病病毒感染,因而预防狂犬病从犬-犬或犬-人的传播；为农村地区家养犬建立免疫档案,监控犬只抗体水平,使犬群间形成狂犬病抗体阳性率达到70％以上的坚强免疫带,是预防农村地区狂犬病发生的一种可行、有效的方法.
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流行性腮腺炎暴发原因的研究进展
随着我国扩大免疫规划的实施,流行性腮腺炎大流行基本上得到有效控制,但小规模暴发仍不断发生.本文对近年来国内外流行性腮腺炎暴发流行的相关文献与资料进行分析,发现未接种疫苗、疫苗接种剂次较少及病毒变异、2剂疫苗免疫效力减弱是流行性腮腺炎发病率居高不下的主要原因.
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结核疫苗相关研究现状与展望
结核病,特别是多重耐药性结核病的暴发流行和严重危害性,引起人们的重视.随着耐药菌株与艾滋病的"同流合污",它又一次严重地威胁人类的生命与健康.这些都给此病的防御与治疗带来新的挑战,为此人们不可不对它再次提高警惕.至今,卡介苗(bacillus calmette querin,BCG)仍是预防结核病惟一可用疫苗,但其免疫保护效果极不稳定.过去20年中,分子生物学技术的应用使得新型候选疫苗大量涌现,其中重组BCG疫苗和DNA疫苗被认为是有前途的候选疫苗.但所有疫苗共同的致命缺点是免疫保护力低.佐剂的研究将大大改观这一现状.因此,结核疫苗研究的努力方向还是在研究分支杆菌免疫机制和免疫失败的基础上,进一步增强现有候选疫苗的免疫效力或研制更为有效的新型疫苗.
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DNA疫苗激活CTL反应机制及增强DNA疫苗效力的研究进展
DNA疫苗相对于以前的疫苗免疫策略有着强大的优势,但仍有许多问题待解决,尤其是采用哪些有效的方法来增强DNA免疫的效果,是目前研究关注的热点.本文就近年来DNA疫苗研究中所采用的增强免疫效力的策略作了综述,并就DNA免疫激活CTL反应的有关机制进行讨论.
