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细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404中的表达效率研究
目的 分析细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404株中的表达效率. 方法 用IPTG诱导根癌农杆菌0、1、3、5、7、9、11和13 h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质. 结果 表达产物分子质量单位约为37.5 ku,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达蛋白约占LBA4404菌体总蛋白的20%. 结论 细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31能在LBA4404中表达,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.
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结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达效率的研究
目的 构建结核分枝杆菌(MTB)重组质粒pGEX-ESAT-6,分析ESAT-6抗原在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率. 方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因;将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的高效原核表达载体pGEX-1λT,经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ESAT-6/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定. 结果 PCR扩增出288 bp的ESAT-6基因;双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中,构建了pGEX-ESAT-6穿梭表达载体.SDS-PAGE分析重组质粒pGEX-ESAT-6表达产物的分子质量单位为35 ku,表达效率为20%,Western blot检测该蛋白能被活动性结核病人血清特异识别. 结论 结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6在大肠埃希菌中获得了高效融合表达,表达的ESAT-6重组蛋白具有抗原特异性.
关键词： 分枝杆菌 结核 重组质粒pGEX-ESAT-6 大肠埃希菌 表达效率 -
含不同启动子的重组9型腺相关病毒载体转染大鼠心肌细胞表达效率的差异
9型腺相关病毒( AAV9)作为基因治疗心脏疾病的佳载体之一而成为近年来研究的热点[1],但影响AAV9转导效率的因素很多,其中载体上的启动子和受体细胞是否合适是直接影响到目的基因的转录效率和表达水平的重要因素[2],本研究分别选用含CMV启动子和CBA启动子的rAAV9携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染心肌细胞,比较两个启动子在心肌细胞的转录活性以及对细胞生长的影响,从而为AAV9携带靶基因高效转染心肌细胞以及应用于心脏疾病的基因治疗提供实验资料.
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不同载体表达核酶对HBV mRNA细胞内表达的阻断作用
目的:探讨多位点自剪切核酶及突变核酶对细胞内HBVmuRNA的切割作用.方法:构建5个不同的多位点核酶及突变核酶的真核表达载体,将他们分别与乙型肝炎病毒全基因序列共转染HepG2细胞,用ELISA,共聚焦定量及图像分析的方法观察多位点核酶在细胞内对HBV mRNA切割作用.结果:构建的真核表达载体在细胞内确可表达出多位点核酶,核酶及突变核酶在细胞内对HBV基因的表达均有抑制作用,不同表达载体的抑制率不同,以tRNA启动子的表达载体抑制效率高,达81%,突变核酶亦有部分反义RNA的抑制效果.结论:抗乙型肝炎病毒核酶在细胞内可抑制HBV基因的表达,不同表达载体其核酶的表达效率不同.
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新型化学转染试剂对人脐带间充质干细胞的转染优化
背景:人脐带间充质干细胞的基因修饰技术多种多样,它们在效率、可靠性及安全性方面各有不同.目的:对比3种新型化学转染试剂在人脐带间充质干细胞中的瞬时转染效率.方法:采用Fugene HD、Lipofectamine LTX及Attractene分别转染人脐带间充质干细胞,荧光显微镜下观察阳性细胞,流式细胞术分析不同转染试剂的转染效率,锥虫蓝染色观察转染后人脐带间充质干细胞的生存率.结果与结论:Lipofectamine LTX转染效率高,显著高于Fugene HD和Attractene[(32.50±2.12)%,(4.30±0.64)%,(1.70±0.08)%,P < 0.05].Lipofectamine LTX转染后的细胞生存率略低于Fugene HD及Attractene,但差异无显著性意义[(69.8±6.3)%,(92.4±4.2)%,(106.6±3.9)%,P > 0.05].提示Lipofectamine LTX是人脐带间充质干细胞较为理想的化学转染试剂.
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人胚胎干细胞外源基因的瞬时表达效率
背景:人类胚胎干细胞的修饰和操作技术多种多样,它们在效率、可靠性及安全性方面各有不同.目的:对比观察两种化学转染试剂转染含不同启动子的增强型绿色荧光蛋白表达载体在人胚胎干细胞中的表达效率.方法:采用Fugene HD和lipofectamine2000分别转染无滋养层培养的H9细胞,荧光显微镜下观察阳性克隆,流式细胞术分析不同载体pCAG-EGFP、pEGFP-N3在H9细胞中的表达效率.结果与结论:Fugene HD转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为(42.45±3.32)%、(25.95±1.91)%,差异有显著性意义(P < 0.05).lipofectamine2000转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为(1.94±0.18)%、(1.49±0.33)%.采用Fugene HD转染的表达效率均高于lipofectamine2000转染的表达效率(P < 0.05).结果显示在人胚胎干细胞的H9细胞系中,Fugene HD的转染效率显著高于lipofectamine2000;CAG启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白表达效率显著高于CMV启动子.
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真核细胞表达质粒pCMV4增强hCGβ-C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力
目的:比较以pCMV4和pcDNA3为载体的hCGβ-C3d3DNA疫苗的表达效率和免疫效力.方法:分别构建 pcD-NA3-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ-C3d3真核细胞表达质粒,并转染真核细胞瞬时表达系统COS-7细胞,以分析体外表达效率.抽提与纯化pcDNA3、pcDNA3-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ-C3d3质粒.对6周龄BLAB/C小鼠行DNA免疫.于末次免疫后6周采血,用间接ELISA分析实验动物外周血抗hCGβ抗体效价.结果:对COS-7体外表达效率分析,由pCMV4介导的hCGβ-C3d3表达效率明显高于pcDNA3.动物DNA免疫结果,pCMV4-hCGβ-C3d3刺激动物机体产生的免疫应答强度及免疫效果显著高于pcDNA3-hCGβ-C3d3.结论:pCMV4真核表达质粒hCGβ-C3d3体外表达效率及动物DNA免疫效力均显著高于pcDNA3真核表达质粒.
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两种不同的转基因细胞构建体系的比较
目的:比较目的基因在两种不同表达体系构建的转基因细胞上的表达,选择更好的构建体系.方法:脂质体法将重组真核细胞表达载体pcDNA3/PD-L1导入L929细胞,G418(600 μg/ml)筛选抗性细胞株,同时将重组逆转录病毒载体pGEZ-Term/PD-L1与辅助载体共转染293T细胞,包装病毒颗粒,其上清感染L929细胞后,经Zeocin(500 μg/ml) 筛选抗性细胞.流式细胞仪(FCM)检测目的蛋白在两种细胞膜上的表达.结果:两种体系对目的基因的瞬时表达无明显差别;用pcDNA3构建的转基因细胞膜上目的分子表达稳定性差,表达率低,而用pGEZ-Term构建的则目的蛋白稳定高表达,表达率近100%.结论:两种构建体系均能瞬时表达目的分子,pGEZ-Term表达体系更适于构建长期稳定表达目的基因的转基因细胞.
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多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗构建及其表达效率
目的 构建多房棘球绦虫(Em)重组卡介苗(BCG-EmⅡ/3)疫苗,分析EmⅡ/3分子在该疫苗中的表达效率.方法 超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增EmⅡ/3的抗原编码基因:将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG-EmⅡ/3;电穿孔法转化BCG,构建多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗.免疫印迹分析重组BCG-EmⅡ/3疫苗的表达产物.结果 RT-PCR成功扩增出1 680 bp的EmⅡ/3抗原编码基因;双酶切证实EmⅡ/3抗原编码基因成功插入pBCG中;PCR证实rBCG-EmⅡ/3疫苗构建成功;免疫印迹分析发现重组BCG-EmⅡ/3疫苗的表达产物在相对分子质量(Mr)约为65×103处有明显的目的 蛋白表达条带,且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别.结论 成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗,为疫苗的开发和利用打下了坚实的理论基础.
关键词： 多房棘球绦虫 重组BCG-EmⅡ/3疫苗 构建 表达效率 -
RT-PCR检测基因重组腺病毒感染AGZY表达效率及遗传稳定性研究
目的 研究基因重组腺病毒转染人肺腺癌细胞AGZY后目的基因的表达效率及遗传稳定性.方法 以两种rAd分别转染AGZY细胞,RT-PCR半定量检测hIL-2和hGM-CSF基因mRNA表达.结果 rAd-hIL-2、rAd-hGM-CSF在人肺腺癌细胞AGZY内的表达量随时间的增长而增加,细胞传代对表达无明显影响.结论 rAd-hIL-2、rAd-hGM-CSF可在AGZY细胞内稳定表达外源基因,表达强度不受细胞传代影响.
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多房棘球绦虫pBCG-Em14-3-3重组质粒的构建及其在BCG中的表达
目的 构建多房棘球绦虫重组质粒pBCG-Em 14-3-3,并转化BCG进行表达.方法 超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Em 14-3-3抗原编码基因;将该扩增产物定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG- Em 14-3-3;电穿孔法转化BCG,构建多房棘球绦虫重组BCG- Em 14-3-3.免疫印迹分析pBCG- Em 14-3-3的表达产物.结果 RT-PCR成功扩增出779bp的Em 14-3-3抗原编码基因;双酶切证实Em 14-3-3抗原编码基因成功插入pBCG中;PCR证实rBCG- Em 14-3-3构建成功;免疫印迹分析发现pBCG- Em 14-3-3的表达产物在相对分子质量(Mr)约为27×103处有明显的目的蛋白表达条带,且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别.结论 成功构建了多房棘球绦虫重组BCG- Em 14-3-3.
关键词： 多房棘球绦虫 重组pBCG-Em14-3-3 BCG 构建 表达效率 -
不同血清型腺相关病毒介导的增强绿色荧光蛋白转染犬骨髓间充质干细胞的比较
间充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能,增殖能力强,是组织工程种子细胞研究热点之一[1].腺相关病毒(AAV)载体是已知可整合在染色体上长期表达而不致病的病毒载体.为明确AAV1与AAV2载体对MSCs的转染特点和表达效率,我们就rAAV载体介导的增强绿色荧光蛋白(EGFP)对体外培养犬MSCs的转染情况进行了观察.
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重组抗人结肠癌单链抗体的表达与鉴定
我们在构建了抗人结肠癌单链抗体(single chain Fv,scFv)CL-3的基础上,对scFv CL-3在大肠杆菌中的表达及其复性和纯化进行研究,为进一步提高scFv的表达效率,使之能用于肿瘤的放射免疫引导外科手术提供依据[1].
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含不同启动子的GFP载体在不同种属的胚胎干细胞系中的表达效率
目的:对比含不同启动子的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体在hESC及小鼠胚胎干细胞(mESC)的表达效率,为探索ESC及其衍生细胞移植在体内的存活、迁移、分化及整合提供有力的细胞模型.方法:阳离子脂质体转染hESC及mESC ES-D3,荧光显微镜下观察阳性克隆,流式细胞术(FCM)计算不同载体pCX-hrGFP、pIRES-hrGFP在不同种属细胞中的表达效率.结果:两种载体在mESC的表达效率分别为pCX-hrGFP (90±2.5)%, pIRES-hrGFP (0.67±0.02)%, 两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).在hESC的表达效率分别为pCX-hrGFP (0.8±0.1)%, pIRES-hrGFP (0.62±0.08)%,两组间比较有统计学差异(P＜0.05).pCX-hrGFP在mESC及hESC间的表达效率差异有统计学意义 (P＜0.01),pIRES-hrGFP在mESC及hESC间的表达效率差异无统计学意义 (P＞0.05).结论:① CBA启动子引导的GFP表达效率高于CMV启动子.②同一载体在不同种属细胞内表达效率不同.
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应用PEG-3启动子实现靶向性肿瘤基因治疗
目前使用的组织特异性表达的基因启动子大致可分两类:正常组织细胞中特异表达蛋白的基因启动子和疾病状态下组织细胞过表达或特异表达蛋白的基因启动子.研究和应用多的有甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、黑色素瘤的酪氨酸酶(Tyr)及前列腺特异性抗原(PSAP)等基因启动子.但是,这些启动子只局限于某一种或几种特定组织类型的肿瘤而不能广泛作用于不同组织类型的肿瘤细胞,且表达效率不高.而由哥伦比亚大学教授FISHER等[1]发现的PEG-3(Progression-elevated gene-3)是识别肿瘤细胞的特异性标记,其启动子能对大部分不同组织类型的肿瘤细胞实现靶向性基因表达.通过PEG-3实现基因药物对肿瘤细胞的选择性识别与攻击,从而克服肿瘤靶向性治疗的关键障碍.本文就PEG-3启动子的发现,现阶段的研究成果以及应用前景作一综述.
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日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21中的表达
目的：构建日本血吸虫（Sj）重组质粒 pGEX-Sj32并研究其在大肠埃希菌 BL21中的表达效率。方法从该实验室保存的 BL21（pET28α-Sj32）重组菌中抽提质粒 pET28α-Sj32，PCR 扩增 Sj32抗原编码基因，定向克隆入穿梭载体 pGEX-1λT，构建重组质粒 pGEX-Sj32。将重组质粒转化大肠埃希菌 BL21（DE3），经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达；表达产物用SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定。结果 PCR 成功扩增出 Sj32编码基因，并成功构建了重组质粒 pGEX-Sj32；SDS-PAGE显示相对分子质量约为58×103的重组蛋白，薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21％；Western blot 显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论成功构建日本血吸虫重组质粒 pGEX-Sj32，该重组质粒在大肠埃希菌 BL21中得到了高效表达，且表达蛋白具有特异的抗原性。
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细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95构建及其在根癌农杆菌LBA4404中表达效率的研究
目的:构建细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,分析其在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株中的表达效率.方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒;电穿孔转化At(LBA4404),抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.用IPTG分别诱导rAt 0、1、3、5、7、9、11和13h.用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质.结果:471bp Eg95基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95成功转入At(LBA4404).用Bio-Rad Quantity one分析系统分析,表达产物分子质量(Mr)约为16.5 kD,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达效率为约占LBA4404菌体总蛋白的20%.结论:成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,且能在At(LBA4404)中表达,为进一步研究细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组质粒pBI-Eg95 根癌农杆菌 构建 表达效率 -
细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗的构建及其表达效率研究
目的 构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,分析Eg95分子在该疫苗中的表达效率.方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Eg95的抗原编码基因;将该基因定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pB-CG,构建重组质粒pBCG-Eg95;电穿孔法转化BCG,构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗.免疫印迹分析重组BCG-Eg95疫苗的表达产物.结果 RT-PCR成功扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pBCG中;PCR证实rBCG-Eg95疫苗构建成功;免疫印迹分析发现重组BCG-Eg95疫苗的表达产物在相对分子质量(Mr)约为16.5×103处有明显的目的 蛋白表达条带,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别.结论 成功构建了细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为而后的开发利用奠定了理论基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组BCG-Eg95疫苗 构建 表达效率
