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前药热化疗对转CD基因结肠癌细胞SW480的作用机制
目的:探讨5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)热化疗对转染组织特异性胞嘧啶脱氨基酶(cytosine deaminase,CD)基因的大肠癌细胞SW480的作用及机制.方法:脂质体法将CEA基因顺式转录调控序列(TRS)驱动CD基因的组织特异性逆转录病毒载体G1CEACDNa转导入大肠癌细胞SW480,以G418筛选阳性克隆扩增后,采用水浴加温法,43℃作用30 min共3次,同时给予前药5-FC进行敏感试验;RT-PCR法检测目的基因的表达,MTT法检测细胞存活率,电镜检测细胞的形态学变化,流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡.结果:SW480-CEACD细胞在43℃作用30 min共3次条件下,CD基因能稳定表达;热疗本身对SW480细胞有一定的杀伤作用(P＜0.05),转CD基因后,SW480细胞对5-FC的敏感性明显提高(P＜0.01),热疗与前药5-FC合用,对SW480-CEACD的杀伤作用显著大于对未转基因细胞的杀伤作用(P＜0.01,t=4.356,n=9),亦大于单独应用5-FC时对SW480-CEACD细胞的杀伤作用(P＜0.05,t=2.376,n=9),增加了SW480-CEACD细胞对5-FC的敏感性,电镜及流式细胞术检测显示,细胞死亡以细胞凋亡为主,前药热化疗导致结肠癌细胞SW480产生G1期阻滞,凋亡细胞比例增加.结论:热疗与前药5-FC联合应用,导致结肠癌细胞SW480产生G1期阻滞,细胞凋亡比例增加,提高了CEA组织特异性CD/5-FC系统的靶向性杀伤作用.
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FL转基因细胞的构建及膜型FL对U937细胞的体外促增殖效应
目的构建稳定表达人膜型FL分子的转基因细胞株,观察膜型FL和可溶性FL对单核细胞性(M5型)白血病细胞株的体外促增殖效应.方法利用PCR方法克隆人FL全长基因,继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term,转染包装细胞293T,用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞.采用RT-PCR和流式细胞仪表型分析等方法进行鉴定.MTT法分析了L929/FL细胞和可溶性FL体外刺激U937细胞的增殖效应.结果成功构建了稳定表达人膜型FL的转基因细胞L929/FL,膜型FL在体外能够有效促进U937细胞增殖,而可溶性FL并不能有效促进U937细胞的体外增殖.结论成功构建了稳定表达人膜型FL的转基因细胞,并且提示膜型FL在白血病发病机理中可能具有重要作用.
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转虫荧光素酶基因细胞在亲电性化学污染物监测中的应用研究
目的 用亲电性反应元件(EPRE)调控的转虫荧光素酶基因细胞快速评价环境的污染程度.方法 采用分子生物学的方法,将EPRE与TK基本启动子和编码虫荧光素酶(LUC)的基因相融合,构建成EPRE调控的LUC稳定表达载体,将其转染于HeLa细胞,经G418筛选出稳定的细胞株.该细胞经不同浓度的亚砷酸钠(NaAsO2)、氯化镉(CdCl2)、氯化汞(HgCl2)和顺丁烯乙酸二乙酯(DEM)作用后,用荧光素酶试剂盒物测LUC的表达量.结果 DNA测序显示,EPRE调控的LUC稳定表达载体结构框架正确;LUC的表达量与受试物具有一定的剂量-效应关系,其中DEM的剂量-效应关系明显.结论 EPRE调控的转LUC基因细胞构建成功.
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国外信息三则
能治病的人造皮肤把一块含有转基因细胞的人造皮肤移植到病人身上,这些特殊的细胞就会源源不断地生产出治病的蛋白质,就好像病人身上自带了微型制药厂一样.这不是科学幻想,阿根廷科学家在这方面的研究已进入动物试验阶段.
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骨组织工程种子细胞的研究及应用进展
骨组织缺损是外科临床常见的疾病之一.临床植骨术已成为仅次于输血术的组织移植技术.但目前主要应用的自体骨移植、异体骨移植及人工替代品移植技术难以满足临床上各种骨缺损修复的需要.近20年来,随着生物材料、组织工程技术及理论的发展,将骨组织工程技术应用于临床已成为修复骨缺损的趋势.近年来骨组织工程研究发展迅速,已成为有希望首先进入临床应用的组织工程技术之一.随着骨组织工程研究的进展,选择什么样的细胞作为种子细胞(seed cel1)种植在支架材料上成为近年来研究的热点.理想的骨组织工程种子细胞的特点:
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两种不同的转基因细胞构建体系的比较
目的:比较目的基因在两种不同表达体系构建的转基因细胞上的表达,选择更好的构建体系.方法:脂质体法将重组真核细胞表达载体pcDNA3/PD-L1导入L929细胞,G418(600 μg/ml)筛选抗性细胞株,同时将重组逆转录病毒载体pGEZ-Term/PD-L1与辅助载体共转染293T细胞,包装病毒颗粒,其上清感染L929细胞后,经Zeocin(500 μg/ml) 筛选抗性细胞.流式细胞仪(FCM)检测目的蛋白在两种细胞膜上的表达.结果:两种体系对目的基因的瞬时表达无明显差别;用pcDNA3构建的转基因细胞膜上目的分子表达稳定性差,表达率低,而用pGEZ-Term构建的则目的蛋白稳定高表达,表达率近100%.结论:两种构建体系均能瞬时表达目的分子,pGEZ-Term表达体系更适于构建长期稳定表达目的基因的转基因细胞.
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转NGF基因3T3细胞在大鼠坐骨神经缺损中的修复作用
目的了解微囊化转神经生长因子(NGF)基因3T3细胞在修复周围神经缺损中的作用.方法异体静脉桥接神经缺损,形成神经再生室,其内填充微囊化转NGF基因3T3细胞,修复大鼠的坐骨神经10 mm缺失.用微囊化3T3细胞作为对照组.术后12 w,进行辣根过氧化物酶(HRP)示踪实验.结果术后12 w,实验动物均未出现明显炎症及排斥反应.实验组脊髓灰质前角被HRP标记的阳性神经元数明显多于对照组,其差异具有显著性意义(P＜0.05).结论聚赖氨酸/海藻酸钠(APA)微胶囊与周围神经组织有良好的生物相容性;辅加转NGF基因3T3细胞对修复缺损的神经具有良好的桥梁作用和促神经生长作用.
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微囊化转NGF基因NIH3T3细胞填充静脉修复大鼠坐骨神经缺损的作用
目的:了解微囊化转NGF基因NIH3T3细胞在修复周围神经缺损中的作用.方法:SD雄性大白鼠30只,建立大鼠坐骨神经离断模型后随机分为3组,A组:异体静脉桥接神经缺损,形成神经再生室,其内填充微囊化转NGF基因NIH3T3细胞,修复大鼠坐骨神经10 mm缺失;B组:自体神经移植;C组:微囊化NIH3T3细胞.于术后4、8及12周进行足迹试验,术后12周进行电生理学测试及形态学观察.结果:术后4、8和12周不同时间点坐骨神经功能指数,术后12周神经传导速度、再生神经的组织学改变及再生神经纤维的成熟程度A组和B组比较,差异均无显著性(P＞0.05),A组和B组明显优于C组(P＜0.05).结论:聚赖氨酸/海藻酸钠(APA)微胶囊与外周神经组织有良好的生物相容性;辅加微囊化转NGF基因NIH3T3细胞对修复缺损的神经具有良好的桥梁作用和促神经生长作用.
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人ICOS基因转染细胞对抗体产生的影响
利用RT-PCR方法从扁桃体中激活的T细胞mRNA中扩增出ICOS cDNA,继而将ICOS基因插入到逆转录病毒载体pGEZ-Term中,用脂质体法将重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体共同转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清转染L929细胞,经Zeocin筛选获得稳定表达ICOS蛋白的L929细胞株;经RT-PCR、流式细胞仪表型检测证实L929基因转染细胞能稳定表达人ICOS蛋白.利用ICOS和CD40L基因转染细胞联合IL-10以及PWM驱动的B细胞体外培养系统,分析了ICOS在B细胞生长及抗体产生中的作用,实验结果表明,ICOS在PWM体外培养体系中,能有效地促进B细胞生长以及协同IL-10增加IgG的分泌.
关键词： 逆转录病毒 可诱导协同刺激分子(ICOS) 转基因细胞 抗体 -
转基因细胞分泌表皮生长因子生物活性的测定
目的检测转基因细胞分泌的表皮生长因子(EGF)是否具有生物活性。方法将正常表皮细胞加入培养的转基因表皮细胞于上清中培养，与正常表皮细胞加入培养的正常表皮细胞于上清中培养后的生长情况进行比较。通过将培养体系中加入四唑葎(XTT)，检测转基因细胞分泌的EGF是否具有刺激正常表皮细胞快速生长的生物活性。结果实验组细胞增殖率比对照组显著增高。结论制备的转基因表皮细胞可分泌具有刺激正常表皮细胞生长活性的EGF。
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转染人GL50基因细胞株的建立及其对T细胞体外增殖与活化的促进作用
目的:建立稳定表达人协同刺激分子GL50的转基因细胞,探讨其体外对T细胞活化与增殖的协同刺激效应.方法:RT-PCR法从人B淋巴瘤Daudi细胞中克隆人GL50编码区全长基因,经EcoR I和BamH I双酶切后插入pIRES2-EGFP真核表达载体,构建pIRES2-EGFP-GL50重组子.用脂质体法转染小鼠成纤维L929细胞株,经G418长期加压筛选,免疫荧光标记和流式细胞术分析GL50分子在L929/GL50细胞膜上的表达,CCK-8法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析L929/GL50转基因细胞对T淋巴细胞体外增殖与活化的影响.结果:成功建立稳定表达GL50分子的L929/GL50转基因细胞.该转基因细胞在体外能显著地促进T细胞增殖;促进T细胞的活化及其对IL-4、IL-10和IL-17等细胞因子的分泌.结论:ICOS/GL50信号在机体免疫应答过程中发挥了重要作用,GL50转基因细胞的成功构建为进一步研究ICOS/GL50分子的生物学功能奠定了物质基础.
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人4-1BBL转基因细胞株的构建及其生物学功能的研究
目的 为探讨人4-1BBL分子的生物学功能,构建人4-1BBL转基因细胞株.方法 利用RT-PCR方法克隆人4-1BBL全长基因,继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term.重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/4-1BBL与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞.3H-TdR掺入实验分析4-1BBL转基因细胞对T细胞增殖的影响,ELISA法分析细胞因子的分泌.结果 流式细胞仪表型分析结果表明,L929/4-1BBL转基因细胞稳定表达人4-1BBL分子.体外实验表明,L929/4-1BBL细胞能够促进T细胞活化、增殖及IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌.结论 该研究成功克隆了人4-1BBL基因,构建了能稳定表达4-1BBL分子的转基因细胞株L929/4-1BBL,该株转基因细胞能提供有效的4-1BBL共刺激信号,促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌.
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高效液相色谱法测定人肝细胞色素P450 3A4转基因细胞中氨氯地平
目的:研究氨氯地平经人肝细胞色素P450 3A4(CYP3A4)的代谢,建立反相高效液相色谱的测定人肝转基因细胞CYP3A4酶S9孵育液中氨氯地平浓度的方法.方法:与人肝转基因细胞提取的S9上清液孵育之后的样品,用3倍量的甲醇沉淀后离心,取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过后进样.采用Hypersil C18柱,以乙腈-磷酸盐缓冲液(45∶55,v/v,pH 4.5)为流动相,普萘洛尔为内标,在250 nm波长处测定.结果:氨氯地平浓度在0.2～30.0 μg/ml范围内线性关系良好,r=0.9993,方法平均回收率为(98.2±2.4)%(n=5),日内和日间相对标准偏差(RSD)均小于10%,检测限为20 ng/ml,定量限为0.2 μg/ml(回收率为104.0%,RSD为11.4%,n=5).结论:建立的反相高效液相色谱方法简便、准确,可用于研究氨氯地平在人肝CYP3A4转基因细胞中的代谢.
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前药热化疗对转CD基因结肠癌细胞SW480作用及其机制
有研究表明,癌胚抗原(CEA)转录调控序列可控制胞嘧啶脱氨基酶(CD)基因在CEA阳性的大肠癌组织中高效表达,在前药5-FC作用下产生选择性杀肿瘤细胞作用.研究显示,5-FC热化疗可增加其对转基因细胞的靶向性杀伤作用[1],为探讨前药热化疗作用机制,我们进行了初步研究.
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60Co照射对肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞的增殖及TNF-α分泌的影响
目的用60钴(60Co)照射肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞(BEL-7404-TNF细胞),用于制备一种肿瘤疫苗.方法用不同方式及不同剂量的60Co照射BEL-740-TNF细胞及未转基因的BEL-7404细胞,观察照射后细胞增殖情况及肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌量.结果经80Gy60Co连续分量照射的BEL-740-TNF细胞增殖能力丧失,但仍然生存并能持续分泌TNF-α2周以上,细胞在3周内全部死亡.结论用60Co照射BEL-7404-TNF细胞制备肿瘤疫苗是可行的, 80Gy60Co连续分量照射可能是合适剂量.
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人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及在PC12细胞中的转染
为构建长期稳定表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,我们首先制备了慢病毒表达载体,经测序鉴定正确后转染PC12细胞,然后通过细胞的免疫荧光染色检测α-synuclein-V5融合蛋白,PCR法扩增转基因PC12细胞的SNCA片段后进行测序检测突变基因,以及Western blot法检测PC12细胞α-synuclein的表达,从而鉴定转基因细胞能否稳定表达目的基因.结果显示:经测序,pLenti6/V5-SNCA-WT和pLenti6/V5-SNCA-A53T表达质粒构建成功;免疫荧光染色示基因转染后,超过95%的PC12细胞中有α-synuclein-V5融合蛋白表达;转基因细胞的SNCA片段测序结果显示,慢病毒表达载体成功整合入PC12细胞基因组;Weatern blot法检测结果示转基因PC12细胞能够过表达α-synuclein蛋白.以上结果表明我们已成功构建了人野生型和AS3T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体,并且成功建立了稳定的过表达人野生型和AS3T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,这为进一步研究α-突触核蛋白的生理功能及其在Parkinson病发病机制中的作用奠定了基础.
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转基因人表皮细胞移植猪创面后hEGF表达的实验
目的 检测转基因细胞移植于猪的创面后有无人表皮细胞生长因子（hEGF）表达。 方法 将种植于生物硅膜上的转基因细胞和正常表皮细胞移植于猪的创面，在移植后第1、3、5、8、12天取移植创面组织活检，采用免疫组织化学方法，测定移植后创面有无hEGF表达。 结果 移植转基因表皮细胞的创面，hEGF表达阳性；移植正常表皮细胞的创面，hEGF表达阴性。 结论 转染hEGF质粒的表皮细胞可在创面表达hEGF。
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报告基因法检测促胰岛素分泌肽融合蛋白生物学活性
目的:建立报告基因法检测促胰岛素分泌肽融合蛋白(Exendin-4-HSA,Byetalog)生物学活性.方法:将胰高血糖素样肽-l受体(glucagon-likepeptide 1 receptor,GLP-1R)表达载体和cAMP反应元件(cAMP response element,CRE)报告基因载体共转染CHO-K1细胞,经加压筛选和单克隆分离培养获得稳定的单克隆细胞株;使用药物反应强的单克隆细胞株建立报告基因方法;对新建方法进行条件优化,并用优化的方法对促胰岛素分泌肽融合蛋白原液和成品进行生物学活性测定.结果:经加压筛选和单克隆分离培养后获得对Byetalog强反应性的细胞株CHOglpar/crec 14;新建方法剂量反应曲线符合四参数方程,R2砰大于0.99;对促胰岛素分泌肽融合蛋白的原液和成品分别测定3次,RSD值均低于5.0％,回收率在70％～130％之间.结论:报告基因法操作简便,重复性和准确性都较高,有望作为替代方法应用于促胰岛素分泌肽融合蛋白的生物学活性测定.
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细胞色素P450 1A2的转基因细胞及其应用
1引言细胞色素P450(CYP是一种含血红素酶,广泛分布于从细菌到动物中,能代谢各种外源性和内源性化合物.动物肝微粒体中的CYP能代谢外源性物质,如药物、农药、环境污染物、前突变物和/或前致癌物.细胞色素P450 1A2(CYP1A2)能代谢芳香胺、杂环胺、黄曲霉素B1等许多类化合物.转CYP1A2的各种细胞系的建立为研究CYP1A2的功能提供了新的工具.到目前为止,已经建立的细胞系有细菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞.近,CYP1A2和其他微粒体电子转运系统如NADPH-细胞色素P450还原酶共同表达成功,提高了异源性CYP1A2的代谢能力.另外,为了重建杂环胺的完全代谢活化系统,建立了同时表达CYP1A2和二相酶(phase Ⅱ enzyme)N-乙酰转移酶的细胞系.各种永生的细胞系已经在毒理学试验领域内取得发展.下面按不同的细胞系说明它们的应用.
